VEGFR-2拮抗剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型VEGFR‑2拮抗剂。本发明专利技术的化合物，可在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成相关疾病，比如肿瘤或视网膜疾病，如早产儿视网膜病变。本发明专利技术通过多角度实验，证实了其活性及应用。

【技术实现步骤摘要】
VEGFR-2拮抗剂及其应用
本专利技术涉及医药领域。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)家族包括VEGF-A等，VEGF-A可以激活表达在内皮细胞上的酪氨酸激酶受体血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，刺激血管内皮细胞增殖、促进新生血管形成，并进一步促进视网膜病变的发展。首次报道中显示，VEGFR-2是跨膜激酶受体，全长1356个氨基酸。丹酚酸C(SalvianolicacidC)是种植物提取物，经检索，未见其在VEGF靶点的研究。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术的不足，通过大量筛选，得到了一种新型VEGFR-2拮抗剂。本专利技术公开了丹酚酸C作为VEGFR-2拮抗剂的用途，或者在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成相关疾病，比如肿瘤或视网膜疾病，如早产儿视网膜病变。所述拮抗剂是指，能与相应的受体VEGF结合，并能够与配体竞争性结合受体活性位点的一类物质的总称。所述VEGF诱导型血管生成是指，由细胞因子VEGF诱导细胞形成新生血管。附图说明图1展示了对细胞增殖的影响，其中图1a为对ARPE-19细胞的，图1b为对HUVEC细胞的。图2为划痕实验结果，其中图2a为对ARPE-19细胞的，图2b为对HUVEC细胞的。图3为对细胞侵袭的影响。图4为对管状形成的影响，其中图4a为对ARPE-19细胞的，图4b为对HUVEC细胞的。具体实施方式下面实验可能涉及的英文缩写：续表一、对候选小分子M-15(丹酚酸c)，研究内容与方法概述如下：1.6.1候选小分子化合物的亲和力筛选微量热涌动(MST)技术检测小分子化合物与VEGFR-2蛋白的亲和力，并以VEGF165蛋白作为阳性对照。1.6.2候选小分子化合物的体外活性研究(1)通过MTT实验技术检测M-15小分子化合物分别对HUVEC和ARPE-19细胞生长增殖的影响。(2)利用划痕实验，测定M-15小分子化合物分别对HUVEC和ARPE-19细胞迁移的影响。(3)利用Transwell实验，测定M-15小分子化合物对ARPE-19细胞侵袭的影响。(4)利用管状形成实验，测定M-15小分子化合物分别对HUVEC和ARPE-19细胞成管能力的影响。二、具体实验及结果如下：2VEGFR-2拮抗剂的亲和力筛选：2.1部分主要试剂说明HumanVEGFR-2Protein(HisTag)北京百普赛斯生物科技公司HumanVEGF165Protein北京百普赛斯生物科技公司5×MSTBufferNT.115(50mMTris-HCl德国NanoTemper公司pH7.4,150mMNaCl,10mMMgCl2,0.05％Tween-20)MonolithNT.115CapillaryKits德国NanoTemper公司MonolithNTTMProteinLabelingKit德国NanoTemper公司RED-NHS2.3实验方法-小分子化合物分子水平亲和力测定(1)利用NT.115TM蛋白标记试剂盒RED进行靶蛋白VEGFR-2的标记，得到染料-蛋白复合物。NT647染料标记人VEGFR-2-His蛋白本次实验所用到的VEGFR-2-His蛋白初始摩尔浓度为：2.35μM。将20μM50μL的NT647染料与VEGFR-2蛋白混匀，室温，避光反应30min。(2)在此期间进行层析柱的平衡，用PBS7.2平衡3个柱体积(约500μL)即可。(3)标记蛋白的纯化：反应30min结束后，将标记好的蛋白进行凝胶过滤层析，除去未结合的染料。染料蛋白复合物溶液过凝胶柱，待溶液刚渗入柱子后，加入400μLPBS7.2。随着刚加入的400uLPBS7.2刚好完全渗入柱子，立刻加入600μL的PBS7.2。从柱子中滴下的第一滴液体开始接样，总接样量300-400μL左右。最后将凝胶柱冲洗干净，测定标记效率，根据具体的标记强弱进行适当稀释。(4)样品的配制：设定小分子化合物的最高浓度为400μM，然后进行梯度稀释，依次设置16个浓度梯度，每管体积为10μL。最后向稀释的小分子溶液中加入10μL标记好的靶蛋白，等体积混匀。用毛细管吸取混合样品，根据浓度由内向外依次升高摆放于样品槽中。(5)样品的检测：利用软件进行检测、实验数据的分析。2.4实验结果候选小分子化合物与VEGFR-2蛋白的亲和情况：实验中我们选择了其配体蛋白VEGF165作为阳性对照，VEGF165蛋白初始浓度只有1.23μM，无法达到结合浓度的饱和点。但多次重复实验发现MST点始终在拟合的S型曲线周围且重复性良好，说明实验中MST体系可靠。其中M-15的结合力强且拟合曲线比较完美，KD值为0.30μM3VEGFR-2拮抗剂的体外活性研究：3.1主要试剂：RPMI-1640培养基Solarbio公司DMEM/F12液体培养基BI公司MTTSigma-Aldrich公司胎牛血清BI公司基质胶BD公司结晶紫染液北京索莱宝科技有限公司多聚甲醛天津科密欧试剂厂3.2主要试剂配制:(1)PBS(pH＝7.2)溶液：首先称取0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8.0gNaCl及2.08gNa2HPO412H2O，然后用双蒸水定容至1000mL，121℃，高压蒸汽灭菌30min，最后4℃贮存备用。(2)0.25％胰蛋白酶溶液：首先称取40mgEDTA溶于100mLPBS(pH＝7.2)溶液中，121℃，30min，进行高压蒸汽灭菌，然后称取0.5g胰蛋白酶溶于常温的上述混合溶液中，并用0.22μm滤膜过滤除菌，最后分装并保存于-20℃冰箱备用。(3)MTT溶液：用分析天平称取10mg的MTT粉末于20mLPBS(pH＝7.2)中进行溶解，为了加快溶解，可将溶液放置于37℃摇床中避光摇晃至溶解，随后过滤除菌，以上操作过程中要注意避光，最后在细胞间生物安全柜中进行分装，并置于-20℃低温中避光保存备用。(4)0.2％结晶紫溶液：电子天平称取0.2g结晶紫粉末，加入到100mL甲醇中超声溶解，之后过滤并避光保存于4℃冰箱。(5)100ng/μLVEGF：将装有10μgVEGF粉末的EP管进行离心(12000rpm，1min)，使管内蛋白粉末至管底。在生物安全柜中，加入100μL无菌的去离子水，稍稍晃动EP管使粉末沉至管底，常温静置30min溶解。移液枪轻轻吹打混匀，分装于无菌的EP管中，每管分装5μL，此时的VEGF浓度为1ug/μL。取出一管分装好的蛋白，再加入90μL无菌水，充分混匀后的蛋白浓度即100ng/μL，将其再分装至无菌的EP管中，于-80℃低温中保存备用。3.3实验方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.丹酚酸C在制备VEGFR-2拮抗剂中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.丹酚酸C在制备VEGFR-2拮抗剂中的用途。


2.丹酚酸C在制备在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成的药物中的用途。

【专利技术属性】
技术研发人员：李国栋，马晶晶，祁元明，高艳锋，吴亚红，翟文杰，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41