从苏云金芽孢杆菌中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质制造技术

公开了鉴定由苏云金芽孢杆菌基因表达的蛋白质前毒素的方法。根据该方法，首先在ｐＨ约为９．５的含水悬浮液中用胰蛋白水解酶对含前病毒材料如苏云金芽孢杆菌的多分结晶进行有限的水解以产生子毒素。然后在大于１０的恒定ｐＨ下在渐增的盐较好是氯化钠的梯度中用高效阴离子液相层析法分离子毒素。利用具有渐增浓度盐的并在预定时间和以一定速度被引入的一系列缓冲液达到对所使用的柱特异的梯度条件。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从苏云金芽孢杆菌中，特别是苏云金芽孢杆菌的多基因菌株中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质。苏云金芽孢杆菌(以下简称Bt)是一种革兰氏阳性土壤细菌，特征在于它能够在孢子形成期间产生大的结晶多分孢子包含物。这些包含物由表现出高特异性杀昆虫活性的蛋白质(前毒素)组成。它鉴定了许多有不同昆虫宿主毒性谱的Bt菌株。许多菌株都有抗鳞翅目中某些成员之幼虫的活性(迄今已鉴定了有抗100种以上鳞翅昆虫活性的Bt菌株)，但显示对双翅或鞘翅目昆虫有毒性的菌株也是已知的。已证明Bt多分孢子包含物是一种有价值的常规杀昆虫剂代用品。它们对靶昆虫有高度毒性，而且由于它们的特异性而对环境无害。其他昆虫目、动物和植物似乎不受该毒性结晶蛋白质的影响。二十多年前就已使用各种Bt的配方作为生物学杀昆虫剂，以控制农业和森林害虫，并在近年来用以控制各种人和动物疾病的昆虫载体。Bt产生几种类型的毒素，其确切生物化学性质可因菌株不同而不同。其中有些，特别是α和β外毒素，对各种昆虫目或许多细胞类型有毒性。多分孢子结晶包含物毒素(也称为δ内毒素)，其为蛋白质，具有更有限的和特异性的宿主范围。当被幼虫吞噬时，Bt结晶包含物溶解在幼虫中肠中并在幼虫中肠中迅速受到蛋白水解，转化成较小的毒性多肽(分子量范围为23-80KD)。所产生的毒素与宿主昆虫的中肠上皮细胞相互作用，在细胞膜中产生孔隙并破坏渗透压平衡。上皮细胞肿胀并溶解。幼虫停止摄食并最终死亡。已证明敏感昆虫的中肠上皮细胞上存在几种Bt毒素的特异性高亲和性结合位点，这一事实可解释这些毒素的高度特异性。近几年逐渐明确，Bt备有特别大的和可变的杀昆虫蛋白质家族。使用几种实验方法得到的数据表明许多对鳞翅昆虫有毒性的Bt亚种中的结晶蛋白质基因位于一个或多个大的质粒上；在某些亚种中，该基因可被定位在染色体上。Bt前毒素的基因通常是质粒装载的这一事实已使Bt成为基因操作的适用候选物。其中包括，最年已导致产生能够表达Bt结晶蛋白质基因的昆虫抗性转基因农作物。另外，近年也已了解到，许多Bt菌株含有编码前毒素的几个密切相关的基因。例如Bt变种Kurstaki NRD-12菌株即是三基因菌株。几个这样的基因的存在导致由单—Bt菌株产生几种其氨基酸序列密切相关的前毒素。蛋白水解酶在体外或在昆虫中肠内对这些前毒素混合物的酶促作用，产生几种只是少数几个氨基酸残基有所不同的毒素，从而使所得到的毒素混合物难以分离。然而，因为这些小的差异常常是出现在毒素序列的关键区域，所以它们可能造成对所选择的昆虫靶有明显不同的毒性。因为由Bt的多基因菌株所产生的毒素混合物的组合和个别毒素的表达水平可随着发酵条件而变化，所以其对各种昆虫的相对毒性就可能不同，而且作为一种结果，多基因Bt菌株的宿主范围也有所差异。因此，为了从多基因生产菌最佳化生产最想要的毒素，监测并定量存在于内毒素结晶中的不同毒素就变得十分重要。从Bt的各个菌株的δ-内毒素中纯化杀昆虫毒素的各种尝试是现存技术中已知的。所提出的典型方法包括用蛋白水解酶如胰蛋白酶或昆虫消化液消化Bt的结晶包含物，然后用各种分析方法，如电泳法、凝胶过滤法和离子交换层析法分离水解产物。然而，这些方法都不能分离和纯化从Bt的多基因菌株中得到的密切相关的毒素。同样，也提出了Bt菌株的许多定性的定量特征。例如包括使用鞭毛抗体，用DNA探针检查基因或检测RNA产生的水平。虽然这些方法可用于确性特征和分类目的，但对于定量基因表达和监测给定菌株的存活性，或生产用于分析杀昆虫活性、协同作用、膜研究或昆虫抗性的个别毒素标准品来说是不能令人满足的。具体地说，Fullmer，C.B.和Wasserman，R.H.〔Analytical Peptide Mapping by High Perform-ance Liquid Chromatograpwy(应用于小肠钙结合蛋白质〕，J.Biol.Chem.254，7208-7212(1979)〕描述了一种包括彻底酶促消化以提供肽混合物的肽酶切图技术。用反相HPLC，结合使用酸和有机溶剂对肽混合物进行分析。在另一参考文献中，Yamamoto，T.〔Identificationof Entomoeidal Toxins of Bacillus thuringion-sis by High Performance Liquid Chromatography，J.Gen.Microbiol，129，2595-2603(1983)〕描述了使用Fullmer等人的方法学制肽酶切图。例如，该文第2601页图4下方第5行述及“不能定位代表蛋白酶抗性核心的峰”。文中强调使用有机溶剂持久地降低或完全破坏毒素的生物学活性。在进一步的参考文献中，Yama mo to，T.，Ehmann A.，Gonzalez，J.M.Jr.和Carlton，B.C.(Expres-sion of Three Genes Coding for 135-KilodaltonEntomocidal Proteinin Bacillus thcaringiensisurrent Microbiol.，17，5-12(1988)〕也描述了同样的制作肽酶切图的方法学。在该参考文献中，在胰蛋白酶水解之前，对前毒素进行预纯化。水解后，使毒素混合物在尿素中变性，并用胰蛋白酶再次消化以使用反相HPLC法制备肽酶切图谱(将肽溶解在酸中并在酸/乙腈混合物中洗脱)。如上所述，如此即可破坏毒素的生物学活性。但不幸的是，使用单一基因标准品得到的肽酶切图谱解释由多基因菌株获得的结果，不能识别出菌株Kurstaki HD-1中cryIA(c)〔6.6〕基因产物的存在。它由其他研究者证明存在的这一基因和其蛋白质毒素是一种很重要的成分。此外，美国专利4,853,331(1989)(Hernstadt，C.and Wilcox E.，Choning and Expression ofBacillus thuningiensis Toxin gene Toxic toBeetles of the oder Coleoptera)描述了单一基因的克隆和由大肠杆菌细胞生产单一Bt蛋白质。用亲和层析法纯化毒素。与我们的发现相反，上述技术都没有提供在保留毒素生物学活性的情况下，鉴定、定量并纯化由Bt基因表达的前毒素的方法。事实上，这些参照文献都有与本专利技术不同的目的，即制备肽酶切图，而其中毒素之生群活性的破坏都是不相干的。然而，在我们的专利技术中，必须保留毒素之生物学活性的基因完整。因此，我们不能使用这些现有技术中所使用的反相HPLC技术。本专利技术提供了鉴定由苏云金芽孢杆菌表达的前毒素的方法，该方法包括-在PH为10至12的含水悬浮液中用蛋白水解酶水解含苏云金芽孢杆菌前毒素的材料，以产生被溶解的子毒素，-在10至12的基本恒定PH和含水条件下对子毒素进行高效阴离子交换液相层析，所说的含水条件相当于使用只含有缓中液的第一冲脱液并在预确定的时间内逐步引入至少一种含有缓冲液和适当的盐的其他洗脱液，洗脱液中盐的浓度及时改变，以致使呈生物学活性状态的子毒素与其他水解产物分离开，并-根据由子毒素产生的层析信号鉴定，并在必要时定量前毒素。可以理解到，根据起始材料的不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定由苏云金芽孢杆菌基因表达的前毒素的方法，该方法包括： －在ＰＨ范围为１０至１２的水悬浮液中用蛋白水解酶水解含苏云金芽孢杆菌前毒素的材料，以产生被溶解的子毒素， －在范围为１０至１２的基本恒定ＰＨ下和相当于使用第一洗脱液的含水条件下对子毒素进行高效阴离子交换液相层析，所说的第一洗脱液只含有缓冲液关在预定的时间内逐步引入至少一种含缓冲液和适当的盐的其他洗脱液，洗脱液中盐是浓度及时改变，以致使子毒素以生物学活性状态与水解的其他产物分离开，并 －根据由子毒素产生的层析信号鉴定并在必要时定量前毒素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：PC玛丽安，RC保尔，矢口诚，L提莫斯，
申请(专利权)人：加拿大国家研究院，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]