弯曲菌的聚糖和糖肽制造技术

发现多个菌株和菌种的弯曲菌都具有共同的聚糖部分，这种聚糖部分存在于许多暴露于表面的糖蛋白中。这种聚糖具有下式的结构：ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，４－［Ｇｌｃ－β１，３］ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，３－Ｂａｃ，其中Ｂａｃ为２，４－二乙酰氨基－２，４，６－三脱氧－Ｄ－吡喃型葡萄糖。这种聚糖和其免疫活性片段具有作为疫苗对抗人类和动物中弯曲菌感染的用途。同时，可以提供与这些化合物特异性结合的抗体。这些抗体和疫苗可以用于预防或中和禽畜中的弯曲菌感染，由此防止这种病原体进入人类的食物链。所述聚糖可以与一个或一个以上的氨基酸相连以形成糖肽。同时，提供检测完整糖蛋白的聚糖结构的方法，该方法包括对所述样品进行高分辨魔角旋转核磁共振（ＨＲ－ＭＡＳＮＭＲ）波谱分析。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及如下领域，即具有生物活性的糖蛋白和糖蛋白的聚糖部分，和用于对抗弯曲菌属细菌的疫苗、抗体和抗体片段。
技术介绍
弯曲菌是一种重要的食物传染病原菌，存在于包括家禽在内的禽畜产品中。因此，需要提供对抗该病原菌在人体内的有害效应的策略。从禽畜体内消除这些病原菌可以作为一种减少人群感染率以及减少受感染的饲养动物发病的方法。糖基化的蛋白，特别是这些化合物的某些聚糖部分代表了免疫策略的可行靶，所述免疫策略是用于减少或消除这些生物体在禽畜中的存在，这样做是为了减少人们在食用或处理动物产品时受污染的危险，也能减少人们因源自禽畜肥料的细菌的粪便释放而受污染的危险。糖蛋白及其片段如聚糖部分也可提供针对弯曲菌感染的疫苗和抗体制剂的基础。提供对研究蛋白质糖基化具有普适性的研究工具也是合乎需要的。蛋白质的糖基化曾经被认为是真核生物特有的现象，但是，现在已经清楚，在古细菌域和真细菌域，该现象都是普遍存在的(1、2)。已经在多种原核生物中鉴定出了N-型和O-型糖苷键，其中在古细菌中，很明显是N-连接的糖占优势，而在真细菌中，迄今为止所鉴定的糖蛋白中O-型连接单元占优势(1、2)。此外，与真核糖蛋白中所观察到的N-和O-连接相比，细菌中的这两种连接可与更广范围的糖一起形成连接。本专利技术人发现，某些糖肽和聚糖部分形成了用以对抗弯曲菌属细菌中多种菌株的疫苗和抗体的有效基础，这是由于在多个菌株和种类中，所述糖肽和聚糖部分以不变的(或几乎不变的)形式广泛存在于这些细菌的表面上。这一聚糖还作为弯曲菌的多个表面糖蛋白的一个成分而存在，因而增强了其作为免疫靶的价值。最近，在肠道病原体空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中鉴定出了一个基因座位，其有可能参与了多种蛋白质的糖基化。这为革兰氏阴性细菌中广泛存在的蛋白质糖基化的途径提供了第一个证据(3)。这一座位被称为pgl(因参与蛋白质的糖基化而得名)，这一座位之内的基因的突变导致多种蛋白质的免疫原性丢失。还显示这些蛋白质的聚糖部分能被来自实验感染的人类志愿者的抗血清所识别(3)。通过pgl的突变使所述聚糖部分去除，在体外会导致粘附和侵入的降低，在体内会导致小鼠建群(mouse colonization)的丢失(4)，这间接表明蛋白质的糖基化影响这一生物体的毒力性质。本专利技术人鉴定并表征了空肠弯曲菌菌株NCTC(国立典型培养物保藏中心)11168中的蛋白质的翻译后修饰，所述菌株的整个基因组序列已由Parkhill等人进行了描述(6)。在这些蛋白质中，能在2D凝胶(双向凝胶)上产生多个斑点的蛋白质是PEB3或称Cj0289c，其为空肠弯曲菌的一种主要的抗原蛋白，由Pei等人最先进行了描述(7)。当纯化之后并用1D SDS-PAGE(单向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分析时，会发现两条分子量相差约1500Da(道尔顿)的带，这两条带的N-末端序列都与真正的PEB3相一致。与我们对PEB3的观察相一致的是，Linton等人(8)使用GalNAc特异的凝集素即大豆凝集素，从空肠弯曲菌中鉴定出两个推定的糖蛋白，其中一个是PEB3，另一个是推定的周质蛋白Cj1670c，他们将该蛋白命名为CgpA。基于许多其它推定的糖蛋白与凝集素结合的能力，作者还观察到这些其它的推定糖蛋白，但是，没有鉴定这些蛋白质。而且，蛋白质与凝集素的结合也受pgl座位的基因的突变的影响。此外，我们已证明了基因pglB的突变特异地影响已鉴定的糖蛋白的糖基化，该基因pglB与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)中N-连接的寡糖基转移酶的STT3亚单位具有同源性，这种同源性间接表明了其在糖蛋白的生物合成中的作用(3、9)。此外，碳水化合物参与所有生命域的各种功能。尽管总的来说，在细菌菌株和相关的菌种之间，糖蛋白及它们的抗原性表面聚糖中的聚糖部分存在着高度差异，但并非总是这样，这些例外提供了供基于抗体或疫苗的策略来清除细菌之用的合适的优秀候选物。特别地，弯曲菌糖蛋白的聚糖部分就是一个这样的碳水化合物。最近，我们致力于表征这种重要的食物传染病原体空肠弯曲菌的糖组(glycome)，结果我们阐明了所有表面聚糖的结构，即脂寡糖(LOS)、荚膜多糖(CPS)、N-连接的聚糖和O-连接的聚糖(5、12-15)。本专利技术人证明，本说明书中描述的七糖至少在几种弯曲菌菌种中是普遍存在的，也在许多包括作为重要的人病原体和兽病原体的菌种的菌株中普遍存在，而且，所述七糖还是多种糖蛋白的成分，这些糖蛋白包括Cj编号为0114、0200c、0289c、0367c等的糖蛋白。这一聚糖部分还具有强烈的免疫原性，因此，这一聚糖(和相关的片段以及糖肽)在作为主动免疫用的疫苗用于对抗弯曲菌属的多种菌株和菌种时是优秀的候选物，并且，其也是用作适合以人体内的或动物体内的弯曲菌为靶的抗体或抗体片段的基础的优选候选物。这里所使用的“禽畜(livestock)”包括哺乳动物和家禽。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种聚糖，该聚糖可以单独存在或与寡肽、氨基酸和/或免疫原性偶联物相连。按照本专利技术的一个方面，本专利技术提供一种包含七糖的化合物，所述七糖具有下式I的结构GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac，其中，Bac是2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃型葡萄糖。式I也包括上述化合物的具有免疫活性的片段。“免疫活性”是指这些片段可包含用于对抗弯曲菌的疫苗的活性成分，或者是指可以提供能特异地与所述化合物结合的抗体或抗体片段，并且这些抗体或抗体片段能中和施用了这些抗体或抗体片段的生物体内的弯曲菌。这些聚糖可以以分离的形式提供或者以与寡肽或氨基酸相连接的形式提供以形成新的糖肽。氨基酸可以包含天冬酰胺以形成N-连接的糖肽。这些聚糖或糖肽可以从革兰氏阴性细菌得到或从其分离和纯化而来。这一糖蛋白聚糖部分也可以提供如下文所讨论的治疗剂和方法的基础。按照本专利技术的另外一个方面，本专利技术提供了检测细菌的糖蛋白的聚糖部分的方法，该方法包括对所述样品进行高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS NMR)波谱分析。该方法可以从该聚糖部分的来源直接检测聚糖部分而不需要纯化蛋白质。按照本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种药物组合物，该药物组合物包含式I七糖和生理学上可接受的载体。优选所述药物组合物还可以包含具有免疫原性的偶联物，该偶联物与所述聚糖或糖肽或其片段和/或免疫刺激剂相连。这样的药物组合物可用作免疫人或动物的疫苗，以对抗由弯曲菌属病原体所引起的疾病。这些疾病例如胃肠感染、格-巴综合征(GBS)和米勒费歇尔(Miller Fisher)综合征、关节炎和菌血症。所述疫苗可以通过一次或一次以上的注射或通过其它医学上可接受的方法施用。按照本专利技术的另一方面，本专利技术提供了与式I聚糖部分相互作用并特异性结合的抗体或抗原结合性抗体片段。当将这些抗体或片段施用给动物或人受者时，它们可以中和一种或一种以上的弯曲菌。这些抗体可以通过多种已知的方法得到，其中包括从先前已经用上述七糖或糖肽免疫过的动物的血清中分离得到，或者制备专门针对所述化合物的鼠单克隆抗体。另一方式是通过重组DNA(脱氧核糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物，该化合物包含下式ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，４－［Ｇｌｃ－β１，３］ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，４－ＧａｌＮＡｃ－α１，３－Ｂａｃ的七糖或其具有免疫活性的片段，其中，Ｂａｃ为２，４－二乙酰氨基－２，４，６－三脱氧－Ｄ－吡喃型葡萄糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺埃尔M扬，吉恩罗伯特布里松，约翰弗兰西斯克里，大卫C沃森，克里斯蒂那M希曼斯基，哈罗德C贾雷尔，
申请(专利权)人：加拿大国家研究院，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]