脂激酶制造技术

本发明专利技术涉及新脂激酶，它是ＰＩ３激酶家族的一部分。ＰＩ３激酶催化在肌醇中加入磷酸，产生肌醇单磷酸，二磷酸和三磷酸。已经暗示肌醇磷酸在调节细胞内发出信号级联中导致具有表达的变化，这种变化，在其它效应中可以导致细胞骨架的重排和调节细胞移动性。更具体地说，本发明专利技术涉及新型人ＰＩ３激酶，ｐ１１０δ，它与ｐ８５反应，具有广泛的磷酸肌醇特异性，对与ＰＩ３激酶ｐ１１０α相同的激酶抑制剂敏感。但是，与前面鉴定的修饰普遍表达方式的ＰＩ３激酶相反，ｐ１１０δ选择性地在白细胞中表达。重要的是，ｐ１１０δ在大多数测试的黑素瘤中显示增强的表达，所以在调节黑素瘤展示的移动特性中起重要作用。所以，鉴定增强或减弱ｐ１１０δ活性的试剂可以阻止癌症的移动。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及属于PI3激酶(PI3K)家族的一部分的新脂激酶，更具体地说，特别涉及新脂激酶的各个方面，但不排外地涉及为了诊断或预测细胞的移动或入侵如癌细胞的转移对所述激酶的表达的鉴定；和为了增强、减弱或防止所述的移动或入侵以便分别增强或限制选定细胞的移动，从而干扰所述的表达或抑制所述激酶的试剂。在同时审查中的专利申请WO93/21328中公开了酶的PI3激酶家族的总结。简言之，这类酶显示磷酸肌醇(下文中称为PI)3-激酶活性。根据细胞信息转导和细胞第二信使系统方面知识的主要进展，已知PI3Ks在调节细胞功能方面起重要的作用。的确，已知的PI3Ks是处于正在增长数目的潜在信号蛋白的成员，这些信号蛋白与配体刺激或细胞转化激活的蛋白质-酪氨酸激酶相关。一旦这种相关成立，它们在细胞信号途径中提供重要的复合物，并朝着得出的结论发展。PI3激酶催化在肌醇脂的肌醇环的3’-OH位置加入磷酸，产生单磷酸磷脂酰肌醇，二磷酸磷脂酰肌醇和三磷酸磷脂酰肌醇(Whitman等人，1988,Stephens等人1989和1991)。在有机物如各种各样的植物，粘质霉菌，酵母，果蝇和哺乳动物中已经鉴定了PI3激酶家族(Zvelebil等人，1996)。在体内不同的PI3激酶产生不同的3’-磷酸肌醇脂。根据它们体外的脂底物的特异性可以区分三类PI3激酶。第一类酶具有广谱底物特异性，并且磷酸化Ptdlns,Ptdlns(4)P和Ptdlns(4,5)P2。第一类PI3激酶包括哺乳动物的p110α,p110β和p110γ(Hiles等人，1992；Hu等人，1993；Stephens等人，1994；Stoyanov等人，1995)。p110α和p110β是密切相关的PI3激酶，它们与p85受体蛋白和结合GTP的Ras反应。已经克隆了两个85千道尔顿(kDa)的亚基，p85α和p85β(Otsu等人，1992)。这些分子含有N-末端src同源-3(SH3)区，与两个富脯氨酸区侧接的断点簇(bcr)同源区和两个src同源-2(SH2)区。从p85α基因替代拼接产生或由不同于p85α/β的基因编码的缩短的p85蛋白质，都缺乏SH3区和bcr区，它们似乎是被独特的短N-末端所替代(Pons等人，1995；Inukai等人，1996；Antonetti等人，1996)。存在于所有p85分子中的SH2区，提供了具有与各种受体和其它细胞蛋白上的磷酸化酪氨酸残基反应的能力的杂二聚体p85/p110PI3Ks。与p110α和β相反，p110γ与p85不反应，而与p101受体蛋白结合(Stephens等人，1996)。p110γ的活性受到G蛋白亚基的刺激。第二类PI3Ks含有至少在体外磷酸化Ptdlns和Ptdlns(4)P而不是Ptdlns(4,5)P2的酶(MacDougall等人，1995；Virbasius等人，1996，Molz等人，1996)。这些PI3Ks在C末端都含有C2区。第二类PI3Ks在体内作用仍未知。第三类PI3K具有限制Ptdlns的底物特异性。这些PI3Ks与酵母Vps34P同源，Vps34P在酵母中参与了新形成的蛋白质从高尔基体运输到空泡，哺乳动物溶酶体的等当量(Stack等人，1995)。酵母和哺乳动物Vps34p存在于与Vps15p,150千道尔顿蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶的复合物中(Stack等人，1995；Volinia等人，1995；Panaretou等人，已提交并公开)。Ptdlns(3)P作为构成物质存在于细胞中，它的水平在细胞外刺激下，很大程度上不改变。相反，Ptdlns(3,4)P2和Ptdlns(3,4,5)P3在休眠细胞中几乎不存在，但在各种生长因子的刺激下快速产生，暗示了很可能有第二信使的功能(Stephens等人，1993)。细胞生理中PI3Ks和它们的磷酸化脂的作用刚刚开始被理解。这些脂可以完成双重作用除了发挥物理作用，在脂双层的弯曲部分有传递电荷的作用，它们同时具有与特异结合蛋白反应和调节它们的定位环境/或活性的能力。其中，这些脂的潜在的靶是蛋白质激酶如蛋白质激酶C同工型，蛋白质激酶N/Rho激活激酶和Akt/RAC/蛋白质激酶B(Toker等人，1994；Palmer等，1995；Burgering和Coffer,1995；Franke等人，1995；James等人，1996；Klippel等人，1996)。Akt/RAC/蛋白质激酶B似乎是在靶如p70 S6激酶和糖原合成酶激酶-3的上游(Chung等人，1994；Cross等人，1995)。PI3Ks同时通过调节核苷酸交换影响小GTP结合蛋白如Rac和Rab5的活性(Hawkins等人，1995；Li等人，1996)。最终，这些作用的联合可以引起细胞骨架的重排，DNA合成/有丝分裂，细胞生存和分化(Vanhaeseroeck等人，1996)。本专利技术描述了哺乳动物新第一类PI3激酶，已经命名为p110δ。这一新PI3激酶是第一类PI3激酶家族的典型，因为它与p85α,p85β和p85γ结合。另外，它也与GTP-ras结合，但如p110α，不与rho和rac结合。它同时拥有与p110α和p110β同样的GTP广谱的磷酸肌醇脂底物特异性，它同时展示了蛋白质激酶活性和与p110α相似的药物敏感性。但是，它的特点是组织分布的选择性。与普遍表达的p110α和p110β相反，p110δ在血液中白细胞群体中，如脾，胸腺，特别是外周血白细胞中表达特别高。除这一发现外，同时还发现p110δ在大多数黑素瘤中表达，但不是在任何黑素细胞中，黑素瘤的正常细胞对应物中。已知展示移动或入侵的组织中的p110δ的自然分布和p110δ在癌细胞中的表达，我们认为p110δ在细胞移动或入侵中起作用，所以这一脂激酶在癌细胞中的表达可以解释癌细胞的转移行为。p110δ的另一个特点是它以依赖于Mn2+的方式自身磷酸化的能力。确实，已经显示自身磷酸化趋向于妨碍蛋白质脂激酶的活性。另外，p110δ含有独特的潜在蛋白蛋白质反应元件，含有富脯氨酸区(如附图说明图1所示，位置292-311，其中20个氨基酸中的8个是脯氨酸)和亮氨酸拉链状区的碱性区(bZIP)(Ing等人，1994和Hirai等人，1996)。结合p85的PI3激酶之间的生化和结构的差异表示它们可以在体内完成独特的功能作用和/或受到特异地调节。本专利技术公开了有关p110δ的人类起源的核酸分子和相应的氨基酸序列数据。利用这一信息，可以确定在各种组织类型中p110δ的表达，特别是确定它在癌组织中的表达，目的是诊断这样的组织的移动或入侵，预测潜在的次级肿瘤的发生。另外，同时可以提供妨碍p110δ的表达或选择性地干扰它的功能的试剂。例如，考虑本专利技术提供的序列资料，可以提供防止p110δ的表达的反义物质。如上所述，本专利技术包括反义低聚核苷酸，它选择性地与编码PI3Kδ蛋白质的核酸分子结合，降低PI3Kδ基因的转录和/或翻译。在任何医疗条件下，需要减弱PI3Kδ基因产物的表达，包括减弱任何归因于PI3Kδ基因表达的肿瘤细胞表现型方面。以这种方式，反义分子可以用于减慢或终止肿瘤细胞表现型的这些方面。如本专利技术所用，术语“反义低聚核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的自身磷酸化多肽，或其片断，具有图１显示的氨基酸序列，或其同源物或类似物代表的ＰＩ３激酶活性，可选择地通过至少一个氨基酸残基的缺失，替代和附加修饰，在血液白细胞和／或黑素瘤中显示选择性表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：巴特万汉斯布罗克，迈克尔德里克沃特菲尔德，
申请(专利权)人：路德维希肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]