稳定化变性脂蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术提供长期保存稳定性优良（即，蛋白质不易变性），可作为血液中变性脂蛋白量测定和生理活性测定用标准物质使用的变性脂蛋白及其制备方法。本发明专利技术的稳定化变性脂蛋白的制备方法包括，人为使脂蛋白变性，获得变性脂蛋白，对该变性脂蛋白进行冷冻干燥；或对含有变性脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤，使该溶液中含有的脂蛋白变性，获得变性脂蛋白，再对该变性脂蛋白进行冷冻干燥。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。详细言之，本专利技术涉及将脂蛋白变性后，冷冻干燥变性脂蛋白而得到的具有优良的长期保存稳定性的变性脂蛋白及其制备方法。本专利技术还涉及变性脂蛋白的制备方法。详细言之，本专利技术涉及的变性脂蛋白的制备方法是对含有脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤而使该脂蛋白变性的方法，并且本专利技术还涉及将这样制备的变性脂蛋白再进行冷冻干燥而得到的具有优良的长期保存稳定性的变性脂蛋白及其制备方法。已知变性脂蛋白与心肌梗塞和心绞痛等冠状动脉系统的疾病、脑梗塞和脑血管性痴呆等脑动脉系统的疾病、或肾病、糖尿病性肾病等肾动脉系统的疾病、以及外周动脉闭塞症等外周动脉系统的疾病等各种循环器官、系统的疾病密切相关，而用于定量测定变性脂蛋白的标准物质以及用于研究变性脂蛋白生理作用和生理活性的各种实验用试剂是决定实验结果的非常重要的物质。因此，稳定化变性脂蛋白的应用体现在，如使其与识别变性脂蛋白的抗体接触，通过测定抗体对样品的反应性来测定血液成分中所含的变性脂蛋白的方法中作为标准物质应用；以及作为研究变性脂蛋白的生理作用和生理活性的各种实验用试剂应用。但是进行这些实验时，由于得到用于测定的标准物质很难，所以使实验变得复杂起来。也就是说，研究变性脂蛋白的生理作用时，例如，有必要从多个设施多次收集血清中的变性脂蛋白来进行比较，因此每次试验每次的测定值必须没有变动，但如果没有在这些试验进行期间稳定且再现性好的标准物质，就不能确保测定时的再现性。另外，因应用不同的标准物质而使测定者间的实验结果出现明显变动的话，将使其生理作用的解释变得复杂，并且得不到一定的结论。这样，虽然能指出其生理重要性，但由于得不到可稳定保存的标准物质，阻断了如通过测定变性脂蛋白的含量作为正确判断疾病的手段应用的路径。通常，如测定血清中蛋白质量时，将所谓的标准血清和纯化状态的目的成分，通过某些方法稳定化后作为标准物质应用。对于脂蛋白而言，例如必要时将含有脂蛋白的血浆或血清与蔗糖等非还原性糖混合，冷冻干燥至水分含量为1～10质量％的范围，由此制备长期保存过程中稳定的标准血浆或标准血清的方法(EP-A-617289号公报)；将由载脂蛋白和脂质得到的构建脂蛋白在蔗糖和甘露醇等稳定剂存在的条件下进行冷冻干燥，使之稳定化的稳定冷冻干燥物的工业制备方法(US-A-5，652399号公报)已有所报道。但是上述公报只是在谋求使脂蛋白不变性的稳定化手段、即力图使脂蛋白稳定化，而对依然未公开。另一方面，已知的制备变性脂蛋白的方法有，通过一些熟知的方法，例如通过超速离心法分离、纯化脂蛋白后，用铜离子等金属离子使之氧化，或与醋酸酐反应使之乙酰化，或与丙二醛等反应的方法，进而分别得到氧化脂蛋白、乙酰化脂蛋白及丙二醛化脂蛋白等变性脂蛋白。但是，用这些方法制备的变性脂蛋白与未变性的脂蛋白同样不稳定，因此不可能在该状态下长时间保存。鉴于这种状况，特开平9-288106号公报公开了将磷脂人为氧化得到的磷脂的氧化物加入到血浆脂蛋白中，用该物质作标准品来测定人氧化脂蛋白的方法。但是，由于上述方法中提及的标准物质的保存稳定性不是十分理想，每次临用时必须重新配制，因此操作显得烦琐。鉴于以上各种情况，急切需要一种能长期稳定保存的变性脂蛋白及其制备方法。因此，本专利技术的目的是提供长期保存稳定性优良(即，测定值不因保存时间的长短而变动)的变性脂蛋白及其制备方法，该变性脂蛋白能作为血液中所含变性脂蛋白量测定用的标准物质，以及可作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂应用。为了解决上述目的，本专利技术者们进一步悉心研究的结果，通过对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤使该溶液中含有的脂蛋白变性后，得到了血液中变性脂蛋白量测定用标准物质和作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂的变性脂蛋白。再通过对所得变性脂蛋白进行冷冻干燥，使变性脂蛋白在干燥状态下的长期保存稳定性及将该干燥状态的变性脂蛋白溶解于溶液后的保存稳定性显著提高，进而达到了本专利技术的目的。在此，本专利技术者们在冷冻干燥时，同样通过应用蔗糖、乳糖、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)等稳定剂，进一步提高了变性脂蛋白的长期保存稳定性，进而更好地解决了上述各种问题。本专利技术者们基于以上观点，完成了本专利技术。也就是说，上述目的是通过如下的稳定化变性脂蛋白的制备方法来达到，该方法包括人为使脂蛋白变性，得到变性脂蛋白，通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化。上述目的还通过如下的变性脂蛋白的制备方法来达到，该方法包括对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤，使该溶液中所含脂蛋白变性。上述目的还通过如下的稳定化变性脂蛋白的制备方法而达到，该方法包括对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤，使该溶液中所含脂蛋白变性，得到变性脂蛋白，再通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化。图2是表示将本专利技术实施例1中所得氧化LDL(用铜氧化的LDL经冷冻干燥)于4℃保存，每隔一定时间用规定的方法进行溶解，以所得产物作样品进行测定时，与用铜氧化的LDL不经冷冻干燥，直接于4℃保存，每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。图3是表示以本专利技术实施例2中所得氧化HDL(用铜氧化的HDL经冷冻干燥后，用规定的方法进行溶解)为样品制作的检测标准曲线的图。图4是表示将本专利技术实施例2中所得氧化HDL(用铜氧化的HDL经冷冻干燥)于4℃保存，每隔一定时间用规定的方法进行溶解，以所得产物作样品进行测定时，与用铜氧化的HDL不经冷冻干燥，直接于4℃保存，每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。图5是表示以本专利技术实施例3中所得氧化脂蛋白a(用铜氧化的Lp(a)经冷冻干燥后，用规定的方法进行溶解)为样品制作的检测标准曲线的图。图6是表示将本专利技术实施例3中所得氧化Lp(a)(用铜氧化的Lp(a)经冷冻干燥)于4℃保存，每隔一定时间用规定的方法进行溶解，以所得产物作样品进行测定时，与用铜氧化的Lp(a)不经冷冻干燥，直接于4℃保存，每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。图7是表示实施例4中，通过对血浆实施包括冷冻的步骤制备变性脂蛋白的图。图8是表示实施例5中，对于实施例5(2)中制备的冷冻变性人血清标准品及实施例1(3)中制备的氧化LDL标准品，用ELISA法评价溶解后保存稳定性时的测定值(吸光度)的比较图。图9是表示实施例6中，通过对人LDL实施包括冷冻的步骤制备变性脂蛋白的图。附图说明图10是表示实施例6中，对于实施例6(2)中制备的冷冻变性LDL标准品及实施例1(3)中制备的氧化LDL标准品，用ELISA法评价溶解后保存稳定性时的测定值(吸光度)的比较图。本专利技术的第一方案是提供稳定化变性脂蛋白的制备方法，它包括人为使脂蛋白变性，得到变性脂蛋白，通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化等步骤。本说明书中“变性脂蛋白”是指氧化脂蛋白、乙酰化脂蛋白及通过丙二醛等作用醛化的脂蛋白等经化学变化的变性脂蛋白，以及经过凝集和3级结构变化等结构变化的变性脂蛋白两种意义；也包含相对于未变性的脂蛋白，发生电荷变化、分子量变化、对生物体内受体的亲和性的变化，及与FOH1a/DLH3(保藏编号FERM BP-7171)产生的抗体(J.Biol.Chem.1994，26915274本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定化变性脂蛋白的制备方法，它包括人为使脂蛋白变性，获得变性脂蛋白，通过对该变性脂蛋白进行冷冻干燥而使该变性脂蛋白稳定化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：重松贵，岛村京子，木村顺治，河野弘明，末重信之，
申请(专利权)人：协和美帝克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]