本发明专利技术属于生物细胞学中构建泡沫细胞模型对药用食用真菌中降血脂有效成分进行筛选的方法。该方法是通过采用氧化低密度脂蛋白OX-LDL诱导巨噬细胞RAW264.7造成脂肪变性的泡沫细胞，并结合油红O染色和测定细胞内的总胆固醇含量以及游离胆固醇和胆固醇脂的含量来检测胞内胆固醇的流出情况，以达到验证该巨噬细胞是否产生脂肪变性和损害以及药物对其治疗效果，通过检测泡沫细胞模型上的治疗效果来检测和筛选食用真菌中降血脂的有效成分。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物细胞学中构建泡沫细胞模型对药用食用真菌中降血脂有效成分进行筛选的方法。
技术介绍
泡沫细胞指富含脂质的吞噬细胞。细胞浆内脂质在制片过程中被有机溶剂溶解而抽提，染色后呈淡色泡沫状结构而得名。泡沫细胞形成是动脉粥样硬化形成的早期事件， 在血管内皮发生损伤的情况下，血液中的单核细胞通过内皮间隙，在内膜下转化为巨噬细胞。巨噬细胞介导渗入血管内皮下的低密度脂蛋白胆固醇发生氧化修饰，形成氧化型低密度脂蛋白胆固醇，并主要通过A型清道受体吞噬大量氧化型低密度脂蛋白胆固醇，导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。传统的检测降血脂药物的方法特别是食用药用真菌中提取到混合物和分离得到的活性物质的方法大多为构建高血脂小鼠模型，但是动物模型具有个体差异大，受操作和环境影响大，用药量大并且后期药效的检测方式复杂，试验周期长耗时耗力，不能进行大规模的应用。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供，有效地解决了目前存在的难题。本专利技术所述的构建泡沫细胞模型检测食用菌中降血脂有效成分的方法，包括下述步骤(1)构建泡沫细胞模型对小鼠单核细胞-巨噬细胞7进行M孔板种板，每孔接种量为2*104个处于对数期的细胞，培养至细胞贴壁率达到60—80%时进行分组，分别设置正常组，模型组，正对照组和加药组；正常组为贴壁率达到60—80%正常巨噬细胞7继续培养M h ； 模型组为在贴壁率达到60—80%的7巨噬细胞中加入终浓度为70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白进行诱导，继续培养M h后形成泡沫细胞；正对照组为贴壁率达到60—80%的巨噬细胞中同时加入终浓度为70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白和终浓度为100 Pg/mL的辛伐他丁继续培养M h ；药物组为贴壁率达到60—80%的巨噬细胞中同时加入终浓度为70 Pg/ml的氧化低密度脂蛋白和终浓度依次为50 Pg/mL、100 Pg/mL、200 Pg/mL的浓度梯度的目的药物继续培养 24 h。(2)细胞泡沫化程度的形态学观察培养24h后，吸去培养基用PBS冲洗细胞数次，中性甲醛固定30 min后加入油红0染液，37°C染色10 min，60%异丙醇脱色后进行倒置显微镜观察并拍照；(3)泡沫细胞脂流出的检测12孔板按每孔2X IO4细胞数接种巨噬细胞7，细胞融合达70-80%按上述第(1)步骤中方法分组为正常组、模型组、正对照组、药物组，弃掉陈旧培养基，换成10%无脂蛋白血清的DMEM培养基培养，继续培养24h后进行脂流出的检测。本专利技术中所述脂流出检测的方法是培养M h后用PBS洗板3次，每次ImL/孔； 每孔中加入1 mL的PBS，细胞刮小心刮取，转移细胞混悬液入相应的玻璃管，室温，离心，800 rpm,2 min ；移走上面PBS，迅速加入体积比3:2的己烷异丙醇溶液，900 μ 1/每孔，提脂， 室温放置30 min ；将溶液平均分两份分别移入4 mL的EP管中，一份用于测定游离胆固醇， 一份用于测定总胆固醇；总胆固醇减去游离胆固醇得到胆固醇酯。本方法是基于细胞学上的降血脂药物的筛选和药效的检测，具有用药量少，检测周期短，操作简单药品消耗少，受环境因素影响小，并且药效检测具有很高的承认度等一系列优点，可以为食用药用真菌中提取的具有降血脂药物的检测和筛选提供可靠的平台。通过实验检测，以辛伐他丁为正对照，在构建的泡沫细胞模型上我们的杏鲍菇水提多糖混合物 PEPE (Pleurotus eryngii water-soluble polysaccharidicextracts)具有很好的促进泡沫细胞的脂流出，与前期动物细胞模型上降血脂功效的检测效果一致。本专利技术不仅可以对大型食用药用真菌中的有效降血脂活性成分进行检测和筛选， 对于其它合成材料或生物活性提取物中的相关降血脂有效成分也能进行鉴定和筛选，并且可以为降血脂在细胞水平上的机理的研究提供依据，具有良好的学术价值和应用前景。附图说明图1是细胞泡沫化程度的形态学观察照片。图2泡沫细胞脂流出检测。具体实施例方式1、构建泡沫细胞模型。对巨噬细胞7 (细胞系是美国ATCC产品，上海申科生物科技有限公司代理销售)进行M孔板种板，每孔接种量为2X IO4个处于对数期的细胞，细胞培养条件为10%DMEM培养基，温度37摄氏度，二氧化碳浓度5%。培养至细胞贴壁率达到60—80%进行泡沫细胞的构建和加药实验，分别设置正常组，模型组，正对照组和加药组。正常组为贴壁率达到60—80%正常巨噬细胞7继续培养M h ；模型组为在贴壁率达到60—80%的7巨噬细胞中加入终浓度为70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白 (OX-LDL)进行诱导，继续培养M h后形成泡沫细胞；正对照组为贴壁率达到60—80%的巨噬细胞中同时加入终浓度为70ug/ml的氧化低密度脂蛋白和终浓度为lOOug/ml的辛伐他丁继续培养M h ；药物组为贴壁率达到60—80%的巨噬细胞中同时加入终浓度为70 Pg/mL 的氧化低密度脂蛋白和终浓度和终浓度依次为50 Pg/mL、100 Pg/mL、200 Pg/mL的浓度梯度的目的药物PEPE继续培养M h。2、细胞泡沫化程度的形态学观察。上述各组处理的细胞培养M h后，吸去培养基用PBS冲洗细胞数次，中性甲醛固定30 min后加入油红0染液，37°C染色10 min, 60%异丙醇脱色后进行倒置显微镜观察并拍照。结果如图1，通过油红0对细胞中的脂质进行染色可以看出，在以RAW^H. 7细胞为基础以氧化低密度脂蛋白诱导形成的泡沫细胞通过采用PEPE治疗后与正对照辛伐他丁和正常细胞以及高脂模型细胞相比较可以看出，在经过 PEPE治疗的泡沫细胞模型均有很好的脂流出效果，相对于高脂泡沫细胞而言得到了很好的治疗效果，与前期我们在小鼠模型上的检测效果是一致的，说明该细胞模型上建立的泡沫细胞模型可以对杏鲍菇水溶性多糖提取物(PEPE)的降血脂成分具有检测和筛选作用。3、泡沫细胞脂流出的检测。1) 12孔板按每孔2 X IO4细胞数接种巨噬细胞7，细胞融合达70-80%按上述第1步骤中方法分组为正常组、模型组、正对照组、药物组，弃掉陈旧培养基，换成10% 无脂蛋白血清(LPDS)的DMEM培养基培养，继续培养24h后进行脂流出的检测，检测方法如下；2)用PBS洗板3次，每次ImL/孔；3)每孔中加入ImL的PBS，细胞刮小心刮取，转移细胞混悬液入相应的玻璃管，室温，离心，800 rpm,2 min ；4)小心移走上面PBS，迅速加入己烷异丙醇溶液(3:2)，900μ 7每孔，提脂，室温放置 30 min ；5)将溶液平均分两份分别移入4mL的EP管中，一份用于测定游离胆固醇(FC)，一份用于测定总胆固醇(TC)。总胆固醇减去游离胆固醇得到胆固醇酯(CE)。在对细胞内的脂质进行提取后进行荧光酶法检测，并与总蛋白进行对比，得到单位蛋白内的脂含量如图2，通过数据可以看出，在经过PEPE治疗后，泡沫细胞中的脂流出相比较于正对照组辛伐他丁和诱导组，经过杏鲍菇水溶性多糖提取物(PEPE)治疗后的泡沫细胞模型中的脂流出显著增加了 20%-40%，并且具有剂量依赖效应，说明该泡沫细胞模型可以很好的起到对食用药本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆玲，雍阳阳，陈晶晶，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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