测定粪便样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法技术

本发明专利技术涉及一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，它解决了现有技术中所采用的试剂和仪器成本高、操作费工费时的问题。本发明专利技术的方法是：（ａ）把抗幽门螺杆菌的抗体／或幽门螺杆菌抗原标记微球，形成免疫微球；（ｂ）把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便悬浮于样品缓冲液中；（ｃ）将已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含粪便的样品缓冲液混合；或将一定抗幽门螺杆菌抗体与含粪便的样品缓冲液混合，然后加入幽门螺杆菌抗原标记微球；（ｄ）检测粪便中可能存在的幽门螺杆菌。本发明专利技术采用免疫微球技术，检测粪便样品中的幽门螺杆菌。它具有成本低廉、操作方便快捷、结果可靠等优点。本发明专利技术的方法主要用于对粪便样品中幽门螺杆菌中的免疫微球的测定。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
幽门螺杆菌属螺杆菌属。它是一种在人胃肠道发现的细菌，已经发现它与人胃十二指肠疾病如胃炎、消化性溃疡、胃癌和其它疾病有密切关系。已经有许多不同的技术用于幽门螺杆菌的测定。依据取材有无创伤性，目前幽门螺杆菌感染的临床诊断方法可分为两大类①无创检查包括血清学方法、同位素标记尿素的呼气试验和胃液聚合酶链反应等。②创伤性检查均为胃镜依赖方法，包括多种形态学、微生物学和分子生物学技术等。上述这些方法均有缺陷，很难满足临床诊断需要。血清学方法采用酶联免疫、免疫酶试验、胶乳凝集试验、Western blot等方法检测外周血清幽门螺杆菌全菌及其组分如细胞毒素的抗体等。由于幽门螺杆菌感染数周后血中才出现特异抗体，阴性者血中也可存在交叉反应性抗体(如空肠弯曲菌感染)，且幽门螺杆菌根除后血中抗体可长时间(＞6个月)维持在阳性水平，故血清学阳性不能完全肯定病人有活动性感染；阴性不能排除初期的感染。因此，血清学抗体的检测只能用于流行病学筛查而不能用于临床诊断，也不能用于疗效观察。同位素标记尿素的呼气试验(C-13和C-14呼气试验)其原理是根据幽门螺杆菌可产生强活性的尿素酶，其分解胃液中的尿素，产生二氧化碳和氨。用C-13或C-14位素标记尿素，让病人口服后被幽门螺杆菌的尿素酶分解，产生C-13或C-14的CO，阳性患者可在呼出气体中检测出C-13(C-13/C-12比例)丰度和C-14(放射性)活性，从而确诊幽门螺杆菌感染，目前被认为是除细菌培养外的诊断“金标准”。但前者需要气体质谱仪，后者有一定的放射性，也需要液体闪烁仪等昂贵仪器，且检查收费标准较高，极大地限制了该方法的应用。胃肠道中的其它细菌也可分泌尿素酶，当这些细菌污染时，可产生假阳性结果。幽门螺杆菌的根除治疗后，尿素酶受到抑制，该方法易导致假阴性结果。基因诊断方法，如插胃管吸取胃液或胃镜抽取胃液或活检组织，提取DNA做聚合酶链反应和探针杂交诊断幽门螺杆菌感染，具有准确性好、检测灵敏度高的优点。还可特异地检测细菌的致病基因如空泡毒素基因等，但操作复杂、易污染，且大大增加了病人的经济开支，对已拥有多种检查手段以诊断幽门螺杆菌感染的今天，不宜提倡作为常规方法。微生物学方法主要为细菌分离培养技术，是诊断幽门螺杆菌感染的“金标准”，同时可以获得诸如抗原制备、药敏试验、分型和致病性研究等所需的细菌。但要求具有一定的厌氧培养条件和技术，作为常规诊断手段不易推广。快速尿素酶试验 是胃镜检查时最常用的Hp感染诊断方法，包括PH指示剂法及分析化学法。多用活检标本，也可用胃液标本检测。另外还有活捡组织病理染色、涂片染色等直接看到细菌等方法，这几种方法均是创伤性检查，需要胃镜取材和判断经验。因此，限制了这些方法的应用。综上所述，幽门螺杆菌的感染最好能直接检查细菌抗原，尤其是粪便样品中的幽门螺杆菌抗原。为此，美国默里迪恩诊断公司提出一种“粪便样品中幽门螺杆菌的免疫测定法”(中国专利申请号97103112.6)。该方法采用酶联免疫检测技术检测粪便样品中幽门螺杆菌抗原，具有灵敏度高、特异性好等优点，但是该方法所采用的试剂成本高，操作费时，需要昂贵的酶标仪等，限制了该方法的使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中所采用的试剂和仪器成本高、操作费时的问题。概述本专利技术提供一种；它包括(a)把抗幽门螺杆菌的抗体/或幽门螺杆菌抗原标记微球，形成免疫微球；(b)把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便悬浮于样品缓冲液中；(c)将已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含粪便的样品缓冲液混合；或将一定抗幽门螺杆菌抗体与含粪便的样品缓冲液混合，然后加入幽门螺杆菌抗原标记微球；(d)检测粪便中可能存在的幽门螺杆菌。在本专利技术的实施方案中，可用来标记的微球(或微粒)的颗粒种类很多，常用的有动物或人红细胞、细菌、多种高分子材料聚合成的微颗粒(如聚苯乙烯胶乳等)、树脂、皂土、明胶颗粒、活性炭、火棉胶、玻璃微球等。优选方案中将采用胶乳和红细胞。在本专利技术的实施方案中，用来标记微球的抗体可以是多克隆抗体，也可以是各种单克隆抗体或其混合。优选方案将采用多克隆抗体。抗体或抗原标记微球的方法有数种物理吸附、化学交联和间接法等。在实施时应根据微球的具体特点和抗体的特性进行选择。粪便样品制备将一定量粪便按适当比例稀释于样品缓冲液中，充分搅拌混匀，低速离心数分钟，取上清液，待测。其中的样品稀释液应含有蛋白质及洗涤剂，可减少非特异性反应。为提高检测敏感度可含粪便的样品缓冲液针对幽门螺杆菌进行浓集处理。检测粪便中可能存在的幽门螺杆菌的方法有直接法和间接法。直接法是指，将抗幽门螺杆菌抗体标记微球，形成免疫微球；直接将免疫微球与含粪便的样品缓冲液混合，检测与免疫微球结合的幽门螺杆菌，如凝集反应、免疫花环、检测免疫微球与缓冲液混合前后缓冲液物理或化学特性的改变(如颜色、浊度、通透性等)、检测免疫微球与缓冲液混合前后微球数量以及物理特性的改变(游离的微球的浓度)等。间接方法通常有凝集抑制反应，其原理是幽门螺杆菌抗原标记的微球与一定量抗该细菌的抗体结合而出现凝集反应，当存在该细菌感染时，粪便中的幽门螺杆菌抗原竞争与抗体结合，从而抑制幽门螺杆菌抗原标记微球的凝集。本专利技术采用免疫微球技术，检测粪便样品中的幽门螺杆菌。它具有成本低廉、操作方便快捷、结果可靠等优点。详细描述本专利技术的测定方法使用了微球，它有许多种类，如动物或人红细胞、细菌、多种高分子材料聚合成胶乳的微粒(如聚苯乙烯胶乳等)、树脂、皂土、明胶颗粒、活性炭、火棉胶、玻璃微球等。优选方案中将采用胶乳和红细胞，以胶乳为最优。胶乳的种类很多，目前常用的是聚苯乙烯胶乳，现有市场上已有各种规格的商品化的胶乳。本专利技术采用的胶乳直径以0.2～1.5微米为优。本专利技术使用了抗幽门螺杆菌的抗体，有单克隆抗体和多克隆抗体两种，常用的为多克隆抗体。这些抗体能够从致敏的动物的血清中获得。目前国内外已有多家公司可提供商品化的抗幽门螺杆菌的抗体，可以较经济的价格获得。中国专利(申请号97103112.6)已详细描述幽门螺杆菌抗体的制备方法。在此仅简述如下把幽门螺杆菌抗原注射到哺乳动物如兔、羊等体内，多次注射适当剂量的抗原，验证试验动物已产生抗幽门螺杆菌抗体，取试验动物血清，经纯化即可得到所需抗体。抗体或抗原标记微球的方法有物理吸附和化学交联等。物理吸附是利用胶乳颗粒表面的带电性，物理吸附方法操作简单方便，但这种结合的牢固度往往较差。随着致敏试剂保存期的延长，脱落比较明显。化学交联指采用含有化学活性基团的胶乳作为载体，抗体或抗原以化学键共价交联在胶乳表面。这种化学交联的性能稳定，保存期长，使用效果有明显提高。胶乳的表面活性基团可以是羧基、氨基或一些其它具有化学活性的基团，它与蛋白质抗原或抗体的结合可以通过缩合剂来完成。将抗体或抗原结合在微球上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。A、物理吸附法先用蒸馏水将胶乳悬液稀释至适当浓度，继将抗体或抗原溶于缓冲液后，逐滴加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混和。混合后可放置室温或37℃，保温一定时间。吸附完成后，离心沉淀，除去游离在上清液中的末吸附物，倾去上清液后，沉淀仍用缓冲液恢复悬浮状态。加入牛血清白蛋白或水解明胶等，使胶乳表面的吸附能力充分饱和，减少非特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，它包括： （ａ）把抗幽门螺杆菌的抗体／或幽门螺杆菌抗原标记微球，形成免疫微球； （ｂ）把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便悬浮于样品缓冲液中； （ｃ）将已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含粪便的样品缓冲液混合；或将抗幽门螺杆菌抗体与含粪便的样品缓冲液混合，然后加入幽门螺杆菌抗原标记的微球； （ｄ）检测粪便中可能存在的幽门螺杆菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王滔，
申请(专利权)人：王滔，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]