粪便样品中幽门螺杆菌的免疫测定法制造技术

一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括：（ａ）把怀凝含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于样品的稀释液中；（ｂ）把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；（ｃ）把该样品和该复合体进行分离；（ｄ）把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用检测剂进行标记；和（ｅ）测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法。幽门螺杆菌是一种在人的胃肠道上部发现的细菌，已经发现它与胃十二指肠疾病如消化性溃疡、胃炎和其它疾病有关。按来源把该细菌分在弯曲杆菌属，然后根据有关它的超微结构和脂肪酸组分方面更详细的资料再分在螺杆菌属。许多不同的技术，如侵入性诊断技术和非侵入性诊断技术已用于测定幽门螺杆菌。侵入性诊断技术包括胃活组织的检查和培养物。非侵入性诊断技术包括脲呼吸试验，其中用饮料的方式给患者用C-13或C-14标记的脲，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)中的抗原测定血清中的幽门螺杆菌的抗体。在Aleonohammad的美国专利5,262,156和Blaser的欧洲专利申请0 329 570中能够发现后一种技术的例子。目前已经鉴别出了好几种主要的抗原并用于测定幽门螺杆菌抗体的免疫测定法中。但是，这些测定法在血清学诊断方面不具有特异性和敏感性。Newell，D.G.，等，Serodian.Immunother.Infer.Dis，.31-6(1989)。这些免疫测定法的一个问题是交叉反应性。对幽门螺杆菌中的主要抗原，尤其是分子量为60Da的假鞭毛蛋白的研究表明这些抗原中的一些对幽门螺杆菌不是特异的并且也在其它细菌如空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌中发现。在设计对幽门螺杆菌的免疫测定法中遇到的第二个问题是菌株的变异。在不同的幽门螺杆菌菌株中已经发现在抗原方面有许多差异。这些问题排除了用单一抗原设计一种测定法。它们也排除了使用单克隆抗体。人们已经尝试改良对幽门螺杆菌抗体免疫测定法的特异性和选择性的一种途径是使用来自不同幽门螺杆菌菌株抗原的混合物，该混合物是用特定的抗原片段富集的。测定血清中幽门螺杆菌抗体的一种酶联免疫吸附试验在商业上能够从Meridian Diagnostics得到。这种测定法使用了一种细菌全细胞溶解产物作抗原。使用一种用抗原测定幽门螺杆菌抗体存在的ELISA有一些缺点。具体是，在治疗感染后人血清中的抗体效价在较长时期内(一些情况是6个多月)仍保持较高。所以，用这种ELISA的阳性试验并不意味着患者目前被感染和需要治疗幽门螺杆菌的感染。当遇到阳性ELISA时，治疗医生通常要求作胃活组织检查来确认在开始抗生素治疗前存在该细菌。所以，以抗原为主的ELISA不能消除对侵入性诊断技术步骤的需求。相反，如果能够设计一种免疫测定法测定幽门螺杆菌抗原替代抗体，由于在患者治疗期间一般测定不到抗原，所以能够显著性地减少对胃活组织检查确认感染的需求。这样，就对测定幽门螺杆菌抗原的ELISA有一种需求，更具体地说，对直接从粪便样品中测定幽门螺杆菌的ELISA有一种需求。尽管人们已知测定粪便样品中微生物如Campylobacter difficile和腺病毒的ELISA，但是，在对幽门螺杆菌呈阳性的患者的胃活组织检查的研究中，该细菌一般不能被培养和从粪便样品中分离出来。这一点和交叉反应性和菌株变异的问题使得可能设计一种对幽门螺杆菌特异并对从粪便样品中直接可靠地测定幽门螺杆菌抗原足够敏感的ELISA更值得怀疑。专利技术概述本专利技术提供了一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括(a)把怀疑含有幽门螺杆菌的一种粪便样品悬浮于样品稀释液中；(b)把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体；(c)把该样品和该复合体进行分离；(d)把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用一种检测剂进行标记；和(e)测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。在本专利技术的优选实施方案中，把第一种抗体结合在了一种载体上并用一种酶标记第二种抗体。也提供了三步三明治的测定法。该免疫测定法将以试剂盒的形式提供，其中试剂盒包括涂有抗体孔的板，样品稀释液，标记的抗体，如酶-抗体结合物，洗涤缓冲液和在ELISA时，一种底物溶液。详细描述本专利技术的免疫测定法使用了幽门螺杆菌的多克隆抗体。这些抗体能够从致敏动物的血清中获得。把抗原注射到产生抗体的样品一般是哺乳动物并优选兔子、山羊或牛来完成致敏作用。一般给一个起始量的注射，接着依次是增强剂量的注射使反应达到最大。理想的注射方法是以多倍剂量形式给白色新西兰兔子。所注射的抗原量必须足以能够引出可测定的足够量的抗体。用试验出血法和间接荧光测定法可证实抗体的产生。现在已经发现ATCC菌株43504的幽门螺杆菌特别适用于产生多克隆抗体。如上所述，已经在幽门螺杆菌中观察到了大量菌株的变异。在不同地理区域以及饮食群中也观察到了有机体的差异。尽管如此，已经发现用菌株43504的细胞致敏得到的抗体用于测定地理区域和饮食群的有机体。如果必要的话，例如，如果发现ELISA在测定特定人群中的有机体无效的话，可把来自一种以上的幽门螺杆菌菌株细胞用于产生抗体。在已知免疫测量方法中所用的相同标记物能够用于标记本专利技术所用的多克隆抗体。在这些标记物中可以提到如美国专利3,940,475所述的用于荧光测定法测定的荧光标记物，如美国专利3,654,090所述的酶标记物和放射性同位素如碘-125。最常用的酶标记物之一是辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶。下列实施例3详细描述了用HRP标记的抗体。用于从被试验的粪便样品中提取抗原物质的方法所用的未标记的多克隆抗体能够固定在任何一种免疫测定法中常用的支持物上。在这些支持物中可使用的是滤纸、塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯或其它适当的试管。把抗体结合在这类物质上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。为了制备用于该测定法的粪便样品，把样品分散在以蛋白质为主的样品稀释液中。把该稀释液配制好并将其缓冲使其交叉反应性最小。作为样品稀释液的例子，能够提到的是胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白(BSA)。现已发现一份粪便样品和四份稀释液的稀释液是可用的。除了使用蛋白质为主的附加剂外，加入清洁剂和增加或降低pH值或稀释缓冲剂的离子强度也能减少交叉反应度。例如，许多样品稀释液以0.05％到2％之间范围浓度含有TritonX-100和/或Tween 20。加0-2.9％ NaCl可改变缓冲体系的离子强度。这些变化通过降低形成中的弱的或非特异性反应来导致较好的特异性。在用于测定法中的抗体溶液和洗涤液的配制中也能体现交叉反应度。该抗体能够在缓冲液中结合上述提到的一种蛋白脲而被提供。通过加入盐和表面活性剂来控制交叉反应度能够配制和缓冲该测定法中所用的洗涤液。降低交叉反应度的优选洗涤液是磷酸盐缓冲溶液。通过下列非限定性的实施例更详细地说明抗原的配制、多克隆抗体的生产和ELISA。实施例1幽门螺杆菌抗原的制备在用5％去纤维蛋白的羊血补加的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上划线分离幽门螺杆菌(ATCC菌株43504)。在37℃微需氧量的环境下把平皿温育6-7天。用克隆形态学、脲酶、过氧化氢酶氧化酶反应和革兰氏染液评估所得到的细菌生长。把可接受的生长传代培养到四个有羊血的琼脂平皿上并在37℃微需氧量的环境下生长3-4天。用5ml的0.85％NaCl浸没每个平皿并用一台平皿涂布器收集细菌生长。在2-8℃下以10,000xg把细菌离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定粪便样品中幽门螺杆菌的方法，它包括： （ａ）把怀疑含有幽门螺杆菌的粪便样品悬浮于一种样品稀释液中； （ｂ）把该稀释液中的粪便样品与幽门螺杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成该抗体和抗原的复合体； （ｃ）把该样品和该复合体进行分离； （ｄ）把该复合体暴露于该抗原的第二种多克隆抗体并把该抗体的一部分与该复合体反应，把所述的第一种和第二种抗体之一结合在一种固体载体上，其它用一种检测剂进行标记；和 （ｅ）测定标记的抗体量并依次测定该粪便样品中幽门螺杆菌抗原的存在。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CV拉卡，CSA伊，KJ科扎克，
申请(专利权)人：默里迪恩生物科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]