人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途制造技术

本文公开的是以纯化和重组形式存在的活性、经分离的β分泌酶的多种形式。该酶参与淀粉样蛋白斑成分的产生，这些成分在患有早老性痴呆的个体中积聚。还公开了产生以单独形式或以与其天然底物（β－ＡＰＰｗｔ和β－ＡＰＰｓｗ）中的一些结合的形式存在的β分泌酶的重组细胞，和针对这些蛋白的抗体。这些组合物可用于对调节β分泌酶的化合物进行选择的方法。β分泌酶的抑制剂作为治疗剂参与神经变性疾病如早老性痴呆的治疗。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及β分泌酶(β-secretase)的多种活性形式的发现，β分泌酶是一种在产生β淀粉状蛋白多肽(Aβ)所必需的两个切割位点之一上切割β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的酶。本专利技术还涉及该酶的抑制剂，这些抑制剂被认为是治疗淀粉状蛋白产生性疾病(amyloidogenicdisease)如早老性痴呆的候选治疗剂。本专利技术的其他方面包括用于发现这类治疗性抑制剂的筛选方法、测定法和试剂盒，以及用于确定个体是否携带该酶的突变形式的诊断方法。
技术介绍
早老性痴呆的特征在于，在脑中，特别是在参与记忆和认知的脑部区域中，存在众多淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结(neurofrillatorytangle)。β淀粉状蛋白多肽(Aβ)是一具有39-43个氨基酸的肽，它是淀粉样蛋白斑的主要成分，通过在一种大蛋白即β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的N末端区域中的特定位点上切割该蛋白而产生。对APP的正常加工涉及在β-AP区域距N末端16-17位氨基酸的C端切割该蛋白、释放所分泌的一胞外结构域——α-sAPP，由此阻止β-AP的产生。通过由β分泌酶在Met671和Asp672之间切割APP及随后在APP的C末端加工，产生Aβ肽，该肽在阿耳茨海默氏病的病因学中占有重要的位置(Seubert等，早老性痴呆的药理学治疗(PharmacologicalTreatment of Alzheimer’s disease)，Wiley-liss，Inc.，345-366页，1997；Zhao，J.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27131407-31411，1996)。并不清楚β分泌酶在早老性痴呆患者中的水平和/或活性是否自然高于正常情况；但清楚的是，其切割产物Aβ肽在这些患者脑中存在的淀粉样蛋白斑中却异常地浓集。因此，为了有助于回答这一问题和其他关于该疾病病因学的问题，可取的是将致病性地切割APP的酶分离、纯化和表征。特别是，将经分离的酶或其活性片段用于根据抑制β分泌酶活性的能力筛选候选化合物的方法，也是人们所希望的。期望对β分泌酶活性有抑制作用的药物可用作治疗早老性痴呆和其他以含原纤维Aβ肽的沉积为特征的淀粉状蛋白产生性疾病的有效治疗剂。美国专利5744346(Chrysler等)描述以大小(当通过凝胶排阻层析测量时，表观分子量在260-300kD的范围内)和酶活性(能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白同种型)为特征的β分泌酶的初始分离和部分纯化。在β分泌酶的纯度方面，通过提供比在先公开的β分泌酶纯至少200倍的纯化的β分泌酶，本专利技术提供了显著的进步。这一纯化的蛋白有多种用途，包括结晶用于结构测定。本专利技术还提供用于产生其大小和酶分布情形与天然存在的形式相同的β分泌酶重组形式的方法。本专利技术进一步发现，人β分泌酶是所谓的“天冬氨酰基”(或“天冬氨酸”)蛋白酶。专利技术概述本专利技术涉及目前已经得到纯化具有表观同质性的一β分泌酶蛋白，特别涉及一纯化的蛋白，其特征在于，在典型β分泌酶测定法——MBP-C125sw底物测定中表现出至少约0.2×105nM/h/μg蛋白、优选至少1.0×105nM/h/μg蛋白的比活性。所得的酶的特征性活性在于它能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)同种型，与来自人293细胞(如早已表征过的那些人293细胞)的溶液化的但未富集的膜级分所表现出的活性相比，该酶的比活性高至少10000倍，优选至少20000倍，更优选多于200000倍。在一实施方式中，纯化的酶在长度上少于450个氨基酸，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO70的多肽。在优选的实施方式中，纯化的蛋白以相对于如SEQ ID NO2所示的本文称之为酶原的各种“截短的形式”存在，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO70、SEQ ID NO69、SEQ ID NO67、SEQ IDNO68、SEQ ID NO58、SEQ ID NO74、SEQ ID NO58。更一般的是，已发现，该酶特别有用的形式的特征在于，N末端在SEQ ID NO2的第46位上且C末端在SEQID NO2的第452位和第470位之间，更特别是，N末端在SEQ ID NO2的第22位上且C末端在SEQ ID NO2的第452位和第470位之间，特别是用于本文所述的结晶学研究时。这些形式被认为在跨膜“锚”域中被切割。其他特别有用的该酶的纯化形式包括SEQ ID NO43、SEQ ID NO66和SEQ ID NO2。更一般的是，现在认识到的是该酶的有用形式的N末端残基对应于选自SEQID NO2的22、46、58和63位残基中的一个残基，其C末端选自位于SEQ ID NO2的452-501位之间或者位于SEQ ID NO2的452-470位之间的一个残基。本文还描述了自小鼠分离的酶的形式，如SEQ IDNO65所示。本专利技术进一步涉及从纯化的β分泌酶蛋白形成的结晶蛋白组合物，例如上述多种蛋白组合物。根据一实施方式，纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物P10-P4’staD→V结合的能力，其至少等于具有氨基酸序列SEQ ID NO70的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的能力。根据另一实施方式，形成结晶组合物的纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物SEQ ID NO72(P10-P4’staV→V)的结合亲合性，该亲合性至少是具有氨基酸序列SEQ ID NO43的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的亲合性的1/100。形成结晶组合物的蛋白可以是糖基化的或脱糖基化的。本专利技术还包括含有β分泌酶底物或抑制剂分子的结晶蛋白组合物，所述抑制剂的例子在本文中提供，具体的例子为由肽衍生的抑制剂，例如SEQ ID NO78、SEQ ID NO72、SEQ ID NO81及其衍生物。一般用于这方面的抑制剂具有不大于约50μM-0.5mM的Ki。本专利技术的另一方面涉及一个经分离的蛋白，包括一多肽，其(i)长度少于约450个氨基酸残基，(ii)包括一个与SEQ ID NO75(包括其保守替换物)至少90％相同的氨基酸序列，和(iii)表现出β分泌酶活性，该活性由其切割底物的能力所证明，所述底物选自在596-597位氨基酸之间被切割的具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)同种型、MBP-C125wt和MBP-C125sw。满足这些标准的肽包括(但不限于)包括序列SEQ ID NO75的多肽，例如SEQ ID NO58、SEQ ID NO58、SEQ ID NO58、SEQ ID NO74，也可包括这些序列的保守替换物。根据另一实施方式，本专利技术包括经分离的蛋白组合物，如上述的那些，其与β分泌酶底物或抑制剂分子结合，例如MBP-C125wt、MBP-C125sw、APP、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。在本专利技术的说明书中具体描述了用于这方面的附加的可被β分泌酶切割的片段。特别有用的抑制剂包括衍生自或包括SEQ ID NO78、SEQ ID NO81和SEQ ID NO72的肽。通常，这些抑制剂具有小于约1μM的Ki。这些抑制剂可被标记上一可测的报告分子。这样的标本文档来自技高网...

【技术保护点】
β分泌酶蛋白，该蛋白已被纯化至具有明显均质性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：约翰P安德森，古里巴尔巴西，米尼丹多恩，诺曼德弗里根，瓦尔吉斯约翰，迈克尔鲍尔，苏坎托辛哈，格温塔苏诺，杰伊廷格，王淑文，利萨麦康恩洛格，
申请(专利权)人：艾兰制药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]