冻干形式的定量一步免疫测定制造技术

借助于特异性结合配偶体例如抗体、抗原、受体和配体来定性和定量测定样品的免疫测定试剂盒，其中包括具有多个孔的载体或微量滴定板。所述载体或微量滴定板是用第一结合配偶体预包被的，并且结合配偶体作为冻干物施加和固定起来。此外，冻干形式的具有递增稀释度的欲测定样品的系列参照标准物在微量滴定板的一部分孔中。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及借助于特异性结合配偶体例如抗体、抗原、受体和配体来定性和定量测定样品的免疫测定试剂盒，其中包括具有多个孔并且用第一结合配偶体预包被的载体或微量滴定板，所述结合配偶体是作为冻干物以固定形式存在。人们在常规诊断和研究诊断中使用免疫测定、酶联免疫测定、荧光标记免疫测定、发光标记免疫测定或用任何其它标记物标记的免疫测定来检测和定量测定蛋白例如抗原、配体、受体、抗体以及化合物。根据现有技术，在这样的检测试剂盒中，其中一种结合配偶体与固体载体例如聚苯乙烯平板结合，而进行检测所需的其它试剂作为检测试剂盒的单独组分加入。这些试剂通常包括作为浓缩物或冻干物以定量形式存在的欲检测的蛋白(参照标准样品)，标准培养基和样品稀释培养基，作为浓缩物或工作溶液以偶联形式(偶联物)存在的第二特异性结合配偶体，如果需要的话第二检测系统，以及对于酶标记物，检测所需的底物试剂。加入停止溶液来终止酶反应，并且可使用通常作为浓缩物存在的测定缓冲液来制备用于第二特异性结合配偶体和第二试剂的工作溶液。因为在工作步骤之间需要洗涤步骤，所以常规免疫测定试剂盒含有通常是浓缩形式的洗涤缓冲液。市售ELISA试剂盒给用户提供了验证的检测系统。这些产品含有进行测定所需的在最佳浓度和量的所有试剂，以及关于如何进行测定的详细说明。各个反应步骤一般是连续进行。对于很多检测系统，被分析物(标准品、样品)和第二抗体与固相(鸡尾酒)的共同培养是可行的。免疫测定的一个典型实例是夹层ELISA(酶联免疫吸附测定)。典型地，这样的ELISA试剂盒包括下列组件·用第一抗体预包被、封闭、固定的具有96个孔的微量滴定板；·参照物质确定浓度的被分析物(标准品)，用于建立系列标准物；·酶-(辣根过氧化物酶)或生物素-偶联的第二抗体；·如果需用的话，链霉抗生物素蛋白酶(辣根过氧化物酶)；·底物溶液(四亚甲基联苯胺)；·洗涤缓冲液盐水溶液，用于在样品培养之前和反应步骤之间洗涤平板；·测定缓冲液用于稀释第二抗体和链霉抗生物素蛋白酶浓度的盐水溶液(制备工作溶液)；·样品稀释培养基特定液体培养基，用于稀释参照物质以及未知样品；·停止溶液，用于终止酶反应。为了进行测定，使用者必须进行下列工作步骤·制备工作溶液；·通过稀释参照物质建立系列标准物；·洗涤微量滴定板；·提供样品稀释培养基；·施加各参照稀释液(系列标准物)；·施加未知样品；·加入酶或生物素偶联的第二抗体；·洗涤微量滴定板；·任选加入链霉抗生物素蛋白酶；·洗涤微量滴定板；·加入底物；·加入停止溶液；·测定光密度。本专利技术的目的是使这样的测定试剂盒容易操作，以及除了定性鉴定以外还能实现定量评定。除了减小实施这种测定所需的工作量和时间以外，本专利技术的目的还有通过将所需操作步骤减到最少来减小使用者出现差错的可能性。最后，本专利技术的目的还是通过明显减小试剂盒的重量和体积来减小包装体积和包装成本以及运输费用，和通过提供具有延长的产品保存期限的标准化基本试剂盒而使后勤容易。为了实现该目的，本专利技术免疫测定试剂盒的特征在于，微量滴定板的一部分孔还包含冻干形式的具有递增稀释度的欲测定样品的系列参照标准物。由于载体或微量滴定板还包含欲测定样品的系列参照标准物，所以除了纯粹的定性分析以外，通过在连续递增的相邻标准物之间的区域里在确定的测定结果之间内推来进行定量评定和定量测定是可行的，同时避免了在实验分析期间制备参照物质的工作溶液和各自的系列稀释物的繁重步骤。这样的免疫测定试剂盒设计不需要制备参照物质的工作溶液和向微量滴定板的孔中引入标准物稀释培养基来制备系列标准物，从而使得方法相当合理和简化，以及特别是提供了可精确重复再现的系列标准物，由此大大降低了出差错的可能性。以特别有利的方式，可进一步加快免疫测定试剂盒的预加工，并且可以进一步减少测定样品所需的步骤。有利起见，将试剂盒的配置设计成这样，即，让微量滴定板的孔还含有冻干形式的第二结合配偶体，特别是第二抗体的酶-或生物素偶联的偶联物，和—当含有生物素偶联的偶联物时—酶。因此，除了以确定的蛋白浓度使用来定量测定欲检测蛋白的系列标准物以外，还引入了用于检测的以冻干形式存在于固相中的与一种上述标记物偶联的第二特异性结合配偶体(滴定浓度的偶联物以及任选第二试剂)和牢固结合在相上的第一结合配偶体，这些组分以冻干形式提供，即在约-30℃低温的脱水形式，其中是将反应动力学冷冻至无需担心参照物质发生预反应的程度。因为高度稀释的工作溶液以及稳定性很差的溶液不是贮存起来，而是仅在临开始测定之前通过加入溶剂或再水化来在载体上制备，所以进一步排除了可能的差错源。为了进一步改进和进一步减少测定所需的工作步骤的数目，将试剂盒的配置设计成这样，即，让微量滴定板的孔包含冻干形式的样品稀释培养基。可在例如2℃将所需量的特定样品稀释培养基加到各自的微量滴定板孔中，同时可在相同温度下向微量滴定板的所有孔中加入第二抗体-酶偶联物或第二抗体与生物素偶联物的混合物，通过在预冷却至例如-30℃的冷冻干燥装置中通过冷冻干燥方法给装料的微量滴定板施加冷冻干燥。为了完成测定试剂盒，这样的预装料的载体或预装料的微量滴定板只需要少量其它另外的组分，有利起见，除了预包被的微量滴定板以外，测定试剂盒仅包含洗涤缓冲液、底物溶液和停止溶液。因此，为了测定样品，仅需要通过向系列标准物的孔中以及任选的空白和样品孔中加入确定体积的蒸馏水来将微量滴定板再水合，然后加入未知的样品并培养。在已经洗涤微量滴定板，并且向用于测定的所有微量滴定板的孔中加入底物之后，经过预先确定的一段时间之后，加入停止溶液，可直接进行测定评价。有利地是如此设计，即，对于生物素偶联的第二抗体偶联物，使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)作为第二试剂。对于使用者来说，依据本专利技术的配置将测定的实施大体上减至加入未知样品以及酶反应，所有其它步骤都已经由ELISA试剂盒的制造商预先进行过了。因此，制造商用特异性第一抗体将微量滴定板包被，封闭并固定，然后将微量滴定板冷却至例如-20℃，并且制造商以确定的方式进行上述另外的步骤，即引入样品稀释剂的系列标准物以及第二抗体-酶偶联物或第二抗体-生物素偶联物与链霉抗生物素蛋白酶的混合物。所以测定的实施被减至加入欲分析的样品和基于底物的颜色评价测定。以特别有利的方式按本专利技术将免疫测定试剂盒设计成这样，即，让测定试剂盒包含过氧化物酶稳定剂和/或常用的裂解保护剂(lyoprotectant)例如蛋白(例如白蛋白(例如BSA)蛋白水解产物(胨、明胶等)酪蛋白)、聚合物(例如葡聚糖、PVA、PVP)、糖(例如蔗糖、海藻糖、乳糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、肌醇)、抑菌剂(例如硫柳汞、proclin)，酚类物质和苯胺类物质，包括具有取代基(小的烷基残基或Cl、Br等)的那些(例如邻甲氧基苯酚、邻甲基苯酚、对甲基苯酚、邻氨基苯酚、邻羟基苯甲酸、(邻、间或对)-羟基苯甲醇、苯胺、对氨基苯甲酸、对甲氧基苯胺、苯甲醇、苯甲酸、对硝基苯酚、苄基胺、1-苯基-1，2-乙二醇、反式-1，2-环己烷二醇、顺式-1，2-环己烷二碳酸、环己基胺)；疏水性化合物和溶剂(例如DMF、乙二醇、DMSO)；洗涤剂(例如吐温20)；芳基硼酸化合物(例如苯基硼酸、4-溴苯基硼酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
借助于特异性结合配偶体例如抗体、抗原、受体和配体来定性和定量测定样品的免疫测定试剂盒，其中包括具有多个孔并且用第一结合配偶体预包被的载体或微量滴定板，所述结合配偶体作为冻干物以固定形式存在，其特征在于，微量滴定板的一部分孔还包含冻干形式的具有递增稀释度的欲测定样品的系列参照标准物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：I雷希魏希塞尔布劳恩，M肖德，
申请(专利权)人：医疗诊断系统有限责任公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]