一种定量、快速的免疫检测方法及其专用装置制造方法及图纸

本发明专利技术为一种定量、快速的免疫检测方法及其专用装置，其特征在于：使用有机高分子荧光纳米微粒为标记，采用专用免疫层析装置，结合与标记相适应的荧光检测仪器，实现定量、快速的免疫检测；其步骤是：以有机高分子荧光纳米微粒标记抗体、抗原（半抗原）或其它特异性结合物质；以免疫层析方式使标记的抗体、抗原或其它特异性结合物质与受体分子结合，通过检测有机高分子荧光纳米微粒的荧光强度实现定量分析。本发明专利技术采用有机高分子荧光纳米微粒为示踪剂，利用荧光物质检测灵敏、测量范围宽的特点，检测灵敏度比目前常用的纳米金标记高１０～１００倍，具有更宽的检测范围，结合检测仪器可实现待测物的准确定量，使该方法同时具有操作简单、快速、定量的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外免疫检测领域，特别是一种基于有机高分子荧光纳米微粒标记的定量、快速免疫检测方法。
技术介绍
如何在不依赖大型仪器设备的条件下通过简单的操作实现快速、准确地定量分析，一直是免疫诊断领域研究的课题。目前，常规的免疫检测主要包括各种发光免疫分析(LIA)、放射免疫分析(RIA)和酶标免疫分析(EIA)。RIA和EIA均为成熟、稳定的免疫检测方法，直到现在，RIA和EIA仍在免疫诊断领域占有重要位置。但RIA所用标记物(常用125I)的可检测性有限，很难实现超灵敏分析；其基于衰变的放射性行为也使其难以建立均相免疫分析方法；更主要的是，其较短的半衰期使RIA试剂难以长时间保存，加上其涉及放射性废物处理、不易实现自动化等缺点，RIA正逐渐被非放射免疫分析取代；EIA做为一种重要的非放射性免疫分析方法目前仍在广泛使用；基于OD值检测的EIA具有测量范围窄、分析灵敏度较低的缺点；以酶为初始标记物、以化学发光或荧光物质为底物的酶放大发光免疫分析克服了以上缺点，但该方式需要一酶促反应；以化学发光物质为标记、以闪烁光检测为特点的LIA，由于其对光信号的引发和收集有严格的要求，对检测仪器的要求很高，目前还没有国产的这类发光测定仪；由于上述原因，近年来时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)发展迅速；TRFIA具有很高的分析灵敏度、宽阔的测量范围、优良的分析精密性和对多个待测物同时检测的能力，成为方法学上颇具优势的非放射免疫分析技术之一。尽管如此，所有上述常规免疫检测体系均要求使用大型的仪器设备，操作步骤比较复杂，检测成本较高，不适合在家庭、社区、急诊实验室和其它现场使用。随着生活水平的提高，人们越来越关注自身的健康状况，许多适合于自测的待测物指标具有很大的市场需求，如排卵监测、糖化血红蛋白的测定；另外，一些适合于急诊的指标，如心脏标志物浓度的测定，也需要采用定量、快速、随机、操作简单的免疫检测模式；此类检测同样也适合于探矿、军事、食品以及社区和小型医院使用，这类检测通常称之为Point Of Care测试。采用胶体金为标记的免疫层析是Point of Care测试的常用模式，目前此类产品多为定性检测，但越来越多的检测需要准确测定样本中的待测物浓度，如心肌梗塞标志物CTn-I、心脏功能评估标志物BNP，等。福州大学的杜民、杨富文等通过分析影响金标记免疫层析定量的各种因素，如生化噪声、光噪声、电噪声等，建立了光谱峰曲线的数学表达模式，利用光电检测系统将纳米金免疫层析试条的色谱信号转换为光谱信号，实现了金标记免疫层析的定量检测，但该方法检测的是纳米金产生的色谱信号，存在分析灵敏度较低、测量范围窄的缺点，该方法的测量范围一般小于二个数量级，而临床上有意义的待测物浓度范围往往在二个数量级以上，因此对于高浓度样本，使用该定量分析体系需要稀释样本，这不仅增加的操作步骤，还可能引入实验误差。此外，对于以纳米金为标记的定量/半定量免疫层析，已经报道的还有张慧、唐江萍等人专利技术的色带递减法免疫层析(中国专利公开号CN1381729A)，李文平、何湘蓉专利技术的半定量免疫层析(中国专利公开号CN1403818A)，和美国拜尔公司R.G.索马专利技术的定量免疫层析检测方法(中国专利公开号CN1146557A)。灵敏度低、测量范围窄是以纳米金为标记的定量/半定量免疫层析难以避免的弊端。以荧光纳米微粒为标记，通过检测荧光信号尤其是稀土离子螯合物的长寿命荧光信号，将大大改善免疫层析检测的分析灵敏度和测量范围，建立综合性能更优越的快速、定量Pointof Care检测体系。应用于生物分析领域的荧光纳米微粒包括无机高分子荧光纳米微粒和有机高分子荧光纳米微粒二类；其中，无机高分子荧光纳米微粒多以二氧化硅为载体，通过微乳液法或溶胶/凝胶法制备；基于此法制备的荧光纳米微粒已经用于临床检测、细胞或组织化学、显微成像等多个领域。公开号为CN1566954A、CN1493647A、CN1707246A、CN1645146A、CN1400467A、CN1707244A的中国专利均涉及到此类无机高分子荧光纳米微粒的制备与应用；公开号为CN1566954A的中国专利还叙述了这种无机二氧化硅荧光纳米微粒在免疫层析中的应用。另一类荧光纳米微粒是以有机基质为骨架的有机高分子荧光纳米微粒(Hrm H，Soukka T and Lvgren T，Clinical Chemistry，2001，47，561-568；T.Soukka，J.Paukkunen，H.Harma，et al.Clinical Chemistry，2001；47，1269-1278)。有机高分子荧光纳米微粒一般通过乳液聚合、无皂聚合等方式制备。同无机高分子荧光纳米微粒相比，有机高分子荧光纳米微粒在体外免疫诊断(如免疫层析)上具有多方面的优点1)可通过共聚合方式(如苯乙烯与丙稀酸的共聚合)使微粒表面带有数量可调节的羧基。这些羧基不仅可以用于标记，而且对纳米粒子胶状体系有很强的稳定作用，使纳米微粒能稳定地贮存于多种介质当中。而二氧化硅纳米微粒表面一般只带有少量-NH2、-OH或-SH，其较弱的离子化作用或较弱的极性对纳米微粒的稳定作用比较有限。2)有机高分子荧光纳米微粒有很好的透光性，对紫外激发光无明显吸收和屏蔽效应，有利于纳米微粒荧光的有效激发。而对于二氧化硅纳米微粒，硅胶基质对紫外激发光有明显吸收，使微粒内包裹的荧光物质的激发减弱，降低了纳米微粒的荧光量子产率(袁景利，叶志强，谭明乾，王桂兰。一种功能性纳米铽荧光探针及其应用，中国专利，公开日2005年12月14日；公开号CN1707246A)。3)有机高分子荧光纳米微粒的内部一般为疏水性环境，对荧光物质，尤其是荧光易被水分子淬灭的稀土离子螯合物，有显著的荧光保护作用，从而使处于微粒内部的荧光分子的荧光得以增强(Ullman EF，Kirakossian H，Singh S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1994，91，5426-5430)。而对于二氧化硅纳米微粒，硅胶基质与螯合物之间存在相互作用，这种相互作用可进一步降低纳米微粒的荧光量子产率，使荧光强度减弱(袁景利，叶志强，谭明乾，王桂兰。一种功能性纳米铽荧光探针及其应用，中国专利，公开日2005年12月14日；公开号CN1707246A)。4)由于性状相似，有机高分子荧光纳米微粒与有机螯合物荧光分子之间具有良好的相容性，通过简单的浸入方式即可制备稳定、强荧光的有机高分子荧光纳米微粒。而对于二氧化硅纳介质包裹的荧光物质，在某些情况下易出现泄漏现象(段菁华，王柯敏，谭蔚泓，等。高等学校化学学报，2003，24，255-259)。5)应用于免疫层析的有机高分子荧光纳米微粒(乳胶粒)，其在免疫层析试条上的迁移能力更强，层析带前端平整，层析行为优于无机高分子荧光纳米微粒，如二氧化硅纳米微粒。HrmH，Ullman EF等报道了有机高分子荧光纳米微粒在常规非均相免疫分析和均相免疫分析中的应用(Ullman EF，Kirakossian H，Singh S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1994，91，5426-5430；HrmH，So本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量、快速的免疫检测方法，其特征在于：方法包括以下步骤：　　　　（ａ）用有机高分子荧光纳米微粒标记抗体、抗原或半抗原；　　　　（ｂ）采用免疫层析装置，使标记的抗体、抗原或半抗原与相应的抗原、抗体结合；　　　　（ｃ）利用有机高分子荧光纳米微粒的高度可检测性，以荧光测量仪测量荧光强度，通过与校准品或参比品比对荧光强度实现待测物的定量分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冯波，唐晓燕，
申请(专利权)人：上海新波生物技术有限公司，苏州新波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]