校准微阵列制造技术

一种用于测定样品中的第一分析物含量的分析方法，包括以下步骤：（ｉ）使样品与含有一个或多个第一反应位点和系列第二反应位点的装置接触，其中所述第一反应位点含有对第一分析物具有亲和力的第一配体，所述系列第二反应位点含有各种已知浓度的固定化的第二分析物；（ｉｉ）除去未结合的第一分析物；（ｉｉｉ）使所述装置与第二配体和第三配体接触，其中所述第二配体进行了检测性标记并且对第一分析物具有亲和力，所述第三配体进行了检测性标记并且对第二分析物具有亲和力；（ｉｖ）除去未结合的第二和第三配体；和（ｖ）测定第二和第三配体的含量，其中第三配体的测定被用来建立校准曲线，该校准曲线被用于测定存在于样品中的第一分析物的含量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及提高诊断鉴定中的微阵列(microarray)的性能，特别是用于定量免疫测定的微阵列。
技术介绍
免疫测定是利用一种抗体特定识别分析物的特定结合位点的配体结合测定。所述免疫测定通常包括将配体(抗体、其它蛋白、半抗原等)固定在固相(支持物材料)上，其依次被待测分析物所识别。通过利用特定标记检测试剂可以实现对含水样品中的分析物的测定和定量分析。所述样品中的分析物含量是被结合的标记检测试剂的函数在竞争试验中成反比以及在非竞争试验中成正比。曾经报道过各种的免疫测定，在该免疫测定中含有配体的固相是塑料管(US 3646 346)、盘(J.Lab和Clin.Med.，70820，1967)、多孔支持物(US 4708932，US 4459360)和珠子(Clin Chem.371521，1991)。这些系统中的分析物的定量分析是通过以下步骤来进行的建立各自的外标曲线(external calibration curve)；确定独立固相单元中的每个分析物的浓度。这些校准曲线被储存起来并被用于控制样品的测定，其中所述样品中的特定分析物有待于进行测定。目前愈来愈意识到利用基于微阵列的技术测定多分析物的优势。这些系统提供了更多的灵活性和多用途，同时具有很高的效率和灵敏度。可以在支持物表面处理多个配体，每一个配体限定了所规定小体积(pl或nl)的各自离散测试区域(DTR)，从而允许同时多通道测定和定量分析一种样品中的多个分析物。还大大减少了每次测定试验所需的样品量。GB-A-2324866公开了可在免疫测定中使用的合适微阵列。专利技术概述本专利技术基于对内校系统(internal calibration)可被当作部分微阵列来提高测定系统的精确度的认识。内校系统能够校正分析测定使其在一种微阵列的范围内进行而同时测定样品中目标分析物的未知浓度。根据本专利技术的一个方面，支持物物质含有第一离散反应位点的阵列，每个反应位点包含第一固定化分析物或对第一分析物具有亲和力的分子，以及一系列第二反应位点，这些第二反应位点上具有各种已知浓度的第二分析物。所述各种已知浓度的系列反应位点能够使校准曲线建立起来，该校准曲线可被用于对发生在第一反应位点上的反应进行定量分析。根据本专利技术的第二个方面，用于测定样品中第一分析物的含量的测定方法包括以下步骤(i)使样品与含有一个或多个第一反应位点和系列第二反应位点的装置接触，其中所述第一反应位点含有对第一分析物具有亲和力的第一配体，所述系列第二反应位点含有各种已知浓度的被固定化的第二分析物；(ii)除去未结合的第一分析物；(iii)使所述装置于第二配体和第三配体接触，其中所述第二配体进行了检测性标记并且对第一分析物具有亲和力，其中所述第三配体进行了检测性标记并对第二分析物具有亲和力；(iv)除去未结合的第二和第三配体；和(v)测定与支持物结合的第二和第三配体的含量，其中第三配体的测定被用来建立校准曲线，该校准曲线被用于测定存在于样品中的第一分析物的含量。第一和第二分析物可以是相同的也可以是不同的。根据本专利技术的第三个方面，用于改善测定第一分析物与被固定化在微阵列装置上的第一配体结合的方法包括通过微阵列装置上的含有多种已知浓度的第二分析物的系列反应位点来校准测定。根据本专利技术的第四个方面，在支持物物质上提供了系列反应位点，这些反应位点含有多种已知浓度的分析物，并且这些反应位点在结合试验中被用于提供内部校准对照。本专利技术以简单、方便和有效的方式建立起了用于结合试验的校准对照。将校准对照反应置于与被用于检测生物学样品中的目标分析物的相同载体上，降低了对独立支持物的需要程度并且使得所有反应同时开始。附图描述结合附图对本专利技术进行描述，其中附图说明图1是测定存在于微阵列上的IgM的图示；图2是测定存在于微阵列上的IgG的图示；图3是测定存在于微阵列上的促卵泡激素(FSH)的图示，和图4表示测定针对以下每种物质的IgE的图示禾本科植物花粉和花生(a/a′)、花生(b/b′)、禾本科植物花粉(c/c)和树木花粉(d/d′)、横轴代表以kU/L每DTR表示的IgE浓度，以及纵轴代表相对光单位(RLU)。专利技术描述本专利技术利用了常规微阵列装置。这些装置一般包括适当的支持物材料如硅、塑料、陶瓷或玻璃，离散反应位点定位在该支持物材料上，每个位点含有一种被固定化的分析物。合适的装置公开于GB-A-2324866中，其中的内容被引入本文作为参考。本专利技术中所使用的支持物材料可以是任何适当尺寸或形状的，优选地小于2cm2，更优选地约为或小于1cm2。所述离散反应位点能以任何常规方式进行定位。优选地，所述反应位点之间的间隔距离小于200μm，更优选地小于100μm，最优选地为10-15μm。所述支持物材料优选地具有一平面，分析物被固定化在该平面上。利用常规手段可以将分析物固定在所述材料的表面上。共价固定是优选的。也可以采用被动吸附，但是这种形式的固定化易受pH、温度和离子强度变化的影响，并且在某些情况下导致弱结合分子在温育和冲洗步骤中被释放出来，因而造成较差的重复性。在被固定化以后分子仍保留最大活性当然是理想的。共价固定化可以利用常规技术来实现，典型地是利用能在特定条件下被活化的化学反应连接分子来实现。合适连接分子的实例被记载在GB-A-2324866中。被用于校准系统的分析物可以是相同的或者不同于源自测定试验中的测试样品中的待测分析物。所述分析物可以是任何对特定配体具有亲和力的分子。例如，所述分析物可以是多核苷酸，例如DNA，RNA或其功能类似物。或者，可以使用蛋白或肽，例如酶、抗体、受体或激素。所述分子还可以是病毒或有机化合物。所述装置的优选用途在于免疫测定，其中分析物是一种抗体或抗原。免疫测定技术被广泛用于本
，用于实施它们的方法是显而易见的。在本文中，微阵列含有形成校准系统的系列(第二)反应位点和已知浓度的分析物，和各自含有一种固定化配体的系列(第一)反应位点，所述配体对存在于目标样品中的分子物具有亲和力。所述固定化配体可以是例如被测试样品中的分析物所靶向的特定抗体、变应原或特定酶。在常规技术的基础上，所有这些对技术人员都是显而易见的。对测试样品中的分析物和/或校准系统中的分析物进行测定是通过分别加入另外的检测标记的和对分析物具有亲和力的配体来实现的。例如，所述分析物可以是抗体IgE，而且检测配体可以是用荧光标记物标记了的抗-IgE抗体。这种形式的检测与常规免疫测定中使用的检测是相同的，因此如何实施这些步骤对技术人员来说是显而易见的。基于常规的检测系统，适当的标记对于本
的技术人员来说是显而易见的。例如，所述标记可以是荧光、化学发光、比色或生物发光的。每一装置包含一系列离散反应位点，这些位点含有不同已知量的分析物。这通常被用来建立内标曲线。在本文中，每一反应位点上的用于本专利技术所必需的分析物的浓度可以由技术人员根据分析物的特性等来确定。为了避免不确定性，组成校准系统的每一反应位点处于同一支持物上，而且没有被分界物或屏障间隔开，所述分界物或屏障防止所述位点与相同液体样品接触。技术人员非常清楚怎样范围的分析物浓度应当被用于校准对照。所述浓度范围通常包括用于分析试验的固定化分析物的最大浓度。在一个优选的实施方案中，所述浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种支持物物质，含有第一离散反应位点的阵列以及一系列第二反应位点，每个第一反应位点包含固定化的第一分析物或对第一分析物具有亲和力的配体，第二反应位点含有不同已知浓度的固定在所述支持物上的第二分析物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JV拉蒙，RI麦康尼尔，SP菲茨杰拉德，ML罗德里盖茨，
申请(专利权)人：兰道克斯实验有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]