成像方法技术

用于固定支撑物表面上分离反应地点阵列中所含分子的成像方法，包括：（ｉ）成像该阵列和检测位于和固态支撑物上相对于阵列的已知位置上的第一分子；（ｉｉ）参照第一分子，使检测窗与分离反应地点标注对准；以及（ｉｉｉ）确定每一窗口的可测信号量。该方法用来在阵列上精确定位反应地点，并校正任何失对准。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于多分析物试验的器件和装置。能设计让构成阵列包含固定于固态支撑表面上的高密度的相同或不同分子。这允许用户在一个实验过程中产生多个结果。阵列也具有自动完成分析方法的优点，从而允许实现高样品吞吐量。阵列通常被设计带有位于固态支撑物的空间分离区上的多个单一反应地点。为了产生空间分离区中的阵列，最普通的方法是采用光刻技术。固态支撑物被光致连接剂覆盖，它仅受适当波长的光辐射时，相对键合配价体被激活。通过在固态支撑表面上放置物理掩膜实现空间解析度。掩膜上的孔图形决定了固态支撑物上的键合区的图形。WO-A-95/16204描述了使用抗生物素蛋白和光敏分子光生物素的光刻方法。空间解析度也被通过被动吸收来实现。例如，US-A-5432099公布了通过离子间相互作用，疏水相互作用和范德华力的结合把分子键合至固态支撑表面上。构成阵列的另一特定例子是关于固态支撑材料与核酸的结合。这些阵列通常由固定于空间分离区的高密度多聚核苷酸矩阵组成。Fodor等，《生物技术趋势》(1994)1219-26描述了使用掩膜保护的化学敏感玻璃表面聚结核酸的方法，而在定义区的暴光允许适当改良的磷氨核苷(phosphoramidites)的吸附。Stimpson等，《PNAS》(1995)926379-6383描述了通过在预定位置把已知多聚核苷酸点溅至固态支撑物上制造构成阵列。为了使用阵列技术时使势能和样品吞吐量最大，必须使来自阵列反应地点的信息处理全自动化。因此，必须进行无手工参与的阵列成像，和进一步地图象数学处理。全自动系统的困难在于有时很难精确定位各反应地点。这可能是由于阵列制造加工本身，其中是不可能使阵列位于各器件的正好相同位置上。此问题也可能是由于实验过程中必需的冲洗步骤中导致装置内器件的轻微移动。由于各分离反应地点可能分开仅10-50μm的距离，很难保证全自动系统精确定位各反应地点。例如，阵列的移动可能与各反应地点间距离为相同数量级。这意味着不能容易地使用用于被分析的各反应地点的图象中的预定窗，因为移动可能导致错误的反应地点落在定义反应地点边界的检测窗内。换句话说，窗口可能错过反应地点，或可能两个地点落在同一窗内。为了更方便的处理，必须保证仅一个反应地点整个落在每个分析物检测窗内。因此，需要改进方法来允许在阵列上精确定位各分离反应地点。根据本专利技术的第一方面，用于固定支撑物表面上分离反应地点阵列中所含分子的包括，(i)阵列成像和固态支撑物上相对于阵列的已知位置上第一分子的检测；(ii)参照第一分子，使检测窗与分离反应地点标注对准；以及(iii)确定各窗口的可测信号量。本方法允许精确定位检测窗，从而改进了传统的自动系统。因为第一分子位于相对于阵列的固态支撑物上的已知位置，使检测窗与阵列反应地点标注对准成为可能。图.2描述了含有参照分子(3)和分析物反应地点阵列(4)的单一生物芯片(2)。图.3描述分析物检测窗(5)与分析物反应地点(4)的标注对准。图.4和5描述含有两个参照分子(3)的生物芯片，它们能用于使检测窗(5)和反应地点正确的标注定位。图.6描述参照分子搜索窗内参照分子的对角线搜索。图.7描述了一个支架上对准的几个生物芯片，使用各生物芯片上的单一参照分子计算支架的旋转角度；以及图.8描述在使用参照分子对准检测窗后，各种分析物实验中获得的图象。这里，术语“检测窗”被用于指明包围二维象素阵列的定义边界，被用于映象可检测的信号。参照分子也能被用于芯片上质量控制检查，因此，例如由于生物芯片的制备，如果可检测信号的密度在预定范围外，此生物芯片的结果可能被剔除。参照分子应定位于每一生物芯片的预定位置。例如，参照分子可能位于生物芯片的一个或多个角落。因此，相应于期望的参照分子位置可在固定位置定义一个或多个检测窗。制造容差是使得参照分子能落在比反应地点或分析物检测窗稍微更大搜索检测窗内，即使阵列的一个或更多的反应地点也可能落在参照分子检测窗内。必须选择用于仅在检测窗内查找各参照分子并忽略其它的反应地点的搜索方法，以确保首先发现参照分子。例如，如参照分子位于各生物芯片的左上角，而从检测窗的左上角开始的对角线搜索将首先遇到参照分子，并因此使得其被正确鉴定(图.2)。对于其它参考位置，搜索方法能被相应调整。能使用传统软件进行搜索来在固态支撑物上移动检测窗而与参照分子标注定位。一旦参照分子位置被鉴定出，分析检测窗可以相对它被定位(如图.3中(5)所示)。或者采用位于已知位置的第二参照分子或者通过认识到第一参照分子被定位于相对反应地点阵列的固定位置上来作辅助。定位参照分子允许决定阵列每一反应地点的位置。在优选实施方案中，生物芯片包括两种参照分子。含两种参照分子还具有的优点是，一旦每一个坐标被决定后，能作检测窗的校准调整。图.4和图.5中的描述最为清楚。第二参照分子相对第一参照分子变化的程度和其期望位置能被计算出，并用于决定生物芯片旋转或失对准的程度。这能更精确的定位分析物检测窗。在图.4中，(6)代表参照分子检测窗内执行搜索的方向。生物芯片上参照分子的坐标被用于定位含被分析分子的分离反应地点的检测窗。信号处理决定可检测信号量，从而决定这一地点上的反应程度。可使用传统技术进行处理，包括共焦显微法或电荷耦合器件法(CCD)。在优选实施方案中，生物芯片器件被用于具有电荷耦合器件来显象阵列的系统中。图象可作如下处理。成像器件被用于产生被拷贝至处理器的图象。然后，多种传统形态平滑操作可执行其上，来产生流畅变化的背景图象。然后这被从原图中减除来产生背景更正图象。通过把阈值以上的图象分段为白色，阈值以下的分段为黑色，能在图象数据中执行传统的阈值操作来产生二进制图象，其中选择适当级别的阈值来查找参照分子。被划分的参照分子将形成离散的相邻“微点”。“微点”分析，是通常用于描述这种离散划分区处理的术语，被用于在预定检测窗中查找形成参照分子部分的象素。“微点”分析一般使用轮廓跟随操作器来跟踪划分区的轮廓，以便形成闭合边界。在数字图象处理或轮廓跟随中普通采用始于1961年的链码或弗雷曼码。这种码及其变体能被用于计算分割目标的周长和大小，且这些参数可以用于检验分割微点的大小和形状落于参照分子期望界线内。如果“微点”太小，太大或形状不正确(例如长高比或圆形)，它可以被剔除—这能使宇宙射线影响，生物芯片壁的杂散反射，闯入窗内的其它分析污点部分等被忽略。使用“微点”分析的商业化程序包括National Instruments的IMAQ视化软件和Stemmer Imaging的CVC；如Data Translation有限公司的Neurocheck 4.2的其它程序使用不同术语(采用相关区而不是微点)，但在用不同搜索策略查找到的区域的测量的象素数据中基本上执行相同的操作。对于位于或接近生物芯片分析物阵列角落的参照分子，二进制化的参照检测窗的对角线搜索(沿适于保证首先发现参照分子的方向)将被用于沿对角线定位位于阈值以上的第一象素，与其它阈值以上象素的连接可在这一象素的周围决定。如果它被直接连接至足够数目的其它阈值以上象素，则可以考虑形成参照分子的部分边界。搜索继续定位所有形成部分边界的阈值以上象素，使用链码闭合边界，在第一边界象素起始和结束，从而仅鉴定形成参本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于固定支撑物表面上分离反应地点阵列中所含分子的成像方法，包括： （ｉ）成像该阵列和检测位于固态支撑物上相对于阵列的已知位置上的第一分子； （ｉｉ）参照第一分子，使检测窗与分离反应地点标注对准；以及 （ｉｉｉ）确定每一窗口的可测信号量。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：约汉维克多拉蒙特，罗伯特伊万迈克康奈尔，斯蒂芬皮特菲兹杰拉德，
申请(专利权)人：兰道克斯实验有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]