对样本成像的方法技术

一种测量样本(3)的方法，所述方法包括以下步骤：(ⅰ)提供第一组分的光；(ⅱ)从由在受到第一组分的光(4)的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒(2)；(ⅲ)形成第一组分的光以提供包括空间受限最小值(19)的光强度分布；(ⅳ)将光强度分布施加到样本上，以使得微粒位于光强度分布的空间受限最小值中；(ⅴ)检测由微粒发射的光子；利用光强度分布的最小值来跟踪微粒的运动，通过：(ⅵ)相对于样本移动光强度分布以使得由微粒发射的光子的速率保持最小，以及(ⅶ)将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置。为了对样本进行成像，所述方法还包括以下步骤：(ⅷ)针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻留时间；以及(ⅸ)对样本上的驻留时间的分布进行绘图。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种对样本成像的方法。
技术介绍
根据跟踪样本中的单个分子的运动的已知方法，利用光来激发分子以发射光子，并且利用对样本成像的二维检测器来检测由分子发射的光子。继而根据由检测器检测的光子的空间分布来确定分子的当前位置。在检测器的像素密度适当的情况下，可以根据处于超过衍射极限的空间分辨率或精度的光子的空间分布来确定分子的当前位置。然而，跟踪处于超过衍射极限的空间精度的微粒的前提是，对于分子的每个位置(即，在分子改变其位置之前)都检测到大量的光子。这是由于较大数量的光子提高了在确定分子的位置中所实现的空间精度的事实，只要在分子发射较大数量的光子的整个时间段内这个位置保持不变。由以分子的位置为中心的圆的半径Δr给出空间精度，该位置是根据二维检测器检测到的由分子发射的光子所在的位置的分布的强度的中心来确定的。分子的真实位置位于这个圆内。半径Δr由下式给出：Δr＝FWHM/N1/2(1)并且半径Δr取决于检测到的光子的数量N以及衍射图样的半最大值全宽度FWHM。由于跟踪单个分子的运动的已知方法针对样本中的分子的每个位置都需要庞大数量N的光子，所以分子严重受压(stressed)，这会导致使分子漂白的风险增加。在漂白的过程中，分子发生化学变化从而在漂白之后分子不再提供光子。除光化学漂白之外，还有可能的是已经被强烈地和/或大量地激发以发射光子的分子转换至亚稳的暗状态中。在一段时间之后，分子可以从亚稳的暗状态返回。然而，在亚稳的暗状态下，分子不会发射用于连续跟踪分子所需的任何光子。因此，仅存在一些分子(即，仅一些所谓的荧光染料或荧光团)适于在已知的方法中使用。许多荧光团漂白得太快，因而不能在延长的时间段或样本内所覆盖的较长距离内跟踪荧光团的运动或者用荧光团标记的分子的运动。在上述方法中，根据二维检测器检测到的由分子发射的光子的所在位置的分布来确定分子的位置。这个方法称为定位。用于在确定光子发射型分子的空间位置方面实现高分辨率或精度的另一种方法是所谓的STED或RESOLFT荧光显微法。此处，有效地激发样本中的分子以发射光子的空间区域被减小到小于衍射极限的尺寸。因此，从样本发射的光子可以归因于尺寸减小的这一特定空间区域，而与检测到光子的位置无关并且与检测到的光子的数量无关。在实践中，有效地激发分子以发射光子的空间区域的减小是通过应用经聚焦的激发光束来实现的，该经聚焦的激发光束与荧光抑制光的一个或多个相干光束的干涉图样叠加。这个干涉图样包括位于激发光束的聚焦区中的基本上零强度的点。对于高绝对强度的荧光抑制光的光束，荧光抑制光的强度在除基本上零强度的点以外的任何地方都超过了饱和强度Is，从而借助于样本中的分子的光子的发射在除基本上零强度的点以外的基本上任何地方都得到抑制。所实现的空间分辨率或精度由下式给出：Δr＝λ/(nsinα(1+I/Is)1/2)(2)其中，I是样本中干涉图样的最大强度。在STED荧光显微法中，对荧光的抑制通过受激发射来实现。在RESOLFT荧光显微法的情况下，对荧光的抑制通过将分子暂时地转换到分子不能够发荧光的构象或其它类型的状态中来实现。由于在STED荧光显微法中需要荧光抑制光的高绝对强度，所以漂白荧光团的风险是相对高的。对于RESOLFT荧光显微法，相对低强度的荧光抑制光是足够的。然而，这个方法仅可以适用于特殊的荧光团，该特殊的荧光团可以切换到荧光团不能够发荧光的构象或其它类型的状态中。一般而言，像STED或RESOLFT荧光显微法这样的方法适用于跟踪样本中微粒的运动，因为微粒是以空间上尺寸减小的区域来进行跟踪的，其中，在该区域中有效地激发微粒以发射荧光。在这种情况下，微粒位于空间上尺寸减小的区域中的标准将会是，由所跟踪的微粒发射的光子的最大速率(rate)。尽管与微粒的连续定位相比根据这个方法进行跟踪需要较少的光子，但微粒和适用于在较长距离内对运动进行跟踪的标记物的数量不会显著增加。此外，在STED和RESOLFT荧光显微法中，必须施加不同的光束，以提供激发光和用于抑制荧光的光。通常，这需要额外的工作，因为不同的光束具有不同的波长并且不同的光束必须在空间上仔细地对齐。根据DE2546952A1，已知基于所谓的衰减全反射的光学系统可以应用于跟踪样本中的微粒的运动。根据DE2546952A1，样本受到驱使微粒发射光子的光的照射。由于照射样本的光的强度分布并不均匀而且经空间调制，所以微粒的运动导致所发射的光子的数量的相应波动。因此，考虑到对强度分布的调制，可以根据检测到的所发射的光子的波动(即，对检测器信号的调制)来总结出微粒的运动。然而，无法跟踪沿光强度恒定的路径运动的微粒的运动。此外，完全无法跟踪在其运动期间从未受到或者很少受到光的照射的微粒。因此，对于利用从DE2546952A1获知的光学系统来跟踪样本中微粒的运动而言，使微粒频繁地受到光的照射是必要的。所以，漂白微粒或标记微粒的标记物的风险不能被有效地消除而必须被接受。根据WO2013/072273A1已知一种包括有独立权利要求1的前序部分的特征的跟踪样本中单个分子的运动的方法。需要一种基于在样本中运动的微粒对样本成像的方法。
技术实现思路
当前专利技术涉及一种对样本成像的方法。所述方法包括以下步骤：(ⅰ)提供第一组分的光；(ⅱ)从由在受到第一组分的光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒；(ⅲ)形成第一组分的光以提供包括空间受限最小值的光强度分布；(ⅳ)将光强度分布施加到样本上，以使得微粒位于光强度分布的空间受限最小值中；(ⅴ)检测由微粒发射的光子；利用光强度分布的最小值来跟踪微粒的运动，通过：(ⅵ)相对于样本移动光强度分布以使得由微粒发射的光子的速率保持最小，以及(ⅶ)将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置；(ⅷ)针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻留时间；以及(ⅸ)对样本上的驻留时间的分布进行绘图。本公开内容的有利的进一步发展归因于权利要求书、说明书以及附图。在本说明书中提及的特征和多个特征的组合的优点仅用作示例，并且可以在不需要根据本公开内容的实施例必须实现这些优点的情况下替代地或累积地使用。在不改变由所附权利要求书限定的保护范围的情况下，就原申请的公开内容和本专利而言以下适用：从附图尤其是从所例示的设计和多个部件相对于彼此的尺寸以及从它们的相对布置和它们的作用连接，可以得知其它特征。本公开内容的不同实施例的特征或者不同权利要求的特征的组合在偏离权...

【技术保护点】
一种对样本成像的方法，所述方法包括以下步骤：提供第一组分的光；从由在受到所述第一组分的所述光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微粒；形成所述第一组分的所述光以提供包括有空间受限最小值的光强度分布；将所述光强度分布施加到所述样本，以使得所述微粒位于所述光强度分布的所述空间受限最小值中；检测由所述微粒发射的光子；以及通过以下方式利用所述光强度分布的所述最小值来跟踪所述微粒的运动：相对于所述样本移动所述光强度分布，以使得由所述微粒发射的所述光子的速率保持最小，以及将在所述样本中的所述光强度分布的所述最小值的实际位置作为所述样本中的所述微粒的实际位置；所述方法的特征在于以下步骤：针对所述样本的多个部分中的每个部分，确定所述微粒的驻留时间；以及对所述样本上的所述驻留时间的分布进行绘图。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.10 US 14/050,5831.一种对样本成像的方法，所述方法包括以下步骤：
提供第一组分的光；
从由在受到所述第一组分的所述光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选
择微粒；
形成所述第一组分的所述光以提供包括有空间受限最小值的光强度分布；
将所述光强度分布施加到所述样本，以使得所述微粒位于所述光强度分布的所述空间
受限最小值中；
检测由所述微粒发射的光子；以及
通过以下方式利用所述光强度分布的所述最小值来跟踪所述微粒的运动：
相对于所述样本移动所述光强度分布，以使得由所述微粒发射的所述光子的速率保持
最小，以及
将在所述样本中的所述光强度分布的所述最小值的实际位置作为所述样本中的所述
微粒的实际位置；
所述方法的特征在于以下步骤：
针对所述样本的多个部分中的每个部分，确定所述微粒的驻留时间；以及
对所述样本上的所述驻留时间的分布进行绘图。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，针对选自由微粒构成的所述组中的多个微粒中的
每个微粒重复跟踪、确定和绘图的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括：
提供与所述第一组分不同的第二组分的其它光；
从由在受到所述其它光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的其它组中选择其它
微粒；
形成所述其它光以提供包括有其它空间受限最小值的其它光强度分布；
将所述其它光强度分布施加到所述样本，以使得所述其它微粒位于所述其它光强度分
布的所述其它空间受限最小值中：
检测由所述其它微粒发射的光子；
通过以下方式利用所述其它光强度分布的所述最小值来跟踪所述其它微粒的运动：
相对于所述样本移动所述其它光强度分布，以使得由所述其它微粒发射的所述光子的
速率保持最小，以及
将所述样本中的所述其它光强度分布的所述其它最小值的实际位置作为所述样本中
的所述其它微粒的实际位置；
针对所述样本中的多个部分中的每个部分，确定所述其它微粒的其它驻留时间；以及
对所述样本上的所述其它驻留时间的分布进行绘图。
4.根据权利要求3所述方法，其中，针对选自由微粒构成的所述组中的多个微粒中的每
个微粒并且针对选自由微粒构成的所述其它组中的多个其它微粒中的每个微粒，重复跟
踪、确定和绘图的步骤。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述光强度分布的所述最小值在
至少一个空间维度上空间受限；其中，利用所述光强度分布的所述最小值在所述最小值在
空间上受限的所有维度的所有方向上对所述微粒或所述其它微粒进行跟踪，并且其中，所
述样本的所述多个部分中的每个部分在所述最小值在空间上受限的所有维度的所有方向
上都空间受限，针对所述样本的所述多个部分中的每个部分确定了所述微粒或所述其它微
粒的所述驻留时间。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，形成所述光或所述其它光以提供
所述光强度分布或所述其它光强度分布，因为对所述光或所述其它光的相干光束的波前进
行调制，并且因为将具有经调制的波前的所述光或所述其它光的光束聚焦到所述样本中，
以提供所述光强度分布或所述其它光强度分布的所述最小值，所述最小值为干涉图样的基
本上零强度的点。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，动态地改变所述波前的调制，以使得所述光强度
分布或所述其它光强度分布的所述最小值在不同的空间维度上交替地空间受限。
8.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，形成所述光或所述其它光以提供
所述光强度分布或所述其它光强度分布，因为将所述光或所述其它光的至少两束相干光束
聚焦到所述样本中的相同聚焦区中，以提供所述光强度分布或所述其它光强度的所述最小
值，所述最小值为干涉图样的基本上零强度的点。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，形成所述光或所述其它光以提供
所述光强度分布或所述其它光强度分布，以使得所述空间受限最小值的空间位置不会随着
所述光或所述其它光的波长而变化。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，通过点检测器来检测所述光子。
11.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中，通过至少两个邻近的点检测器来
检...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·W·黑尔，
申请(专利权)人：马克思普朗克科学促进协会，
类型：发明
国别省市：德国;DE