用于荧光免役检测的CdSe纳米晶复合脂质体微囊泡的制备方法技术

一种用于荧光免役检测的ＣｄＳｅ纳米晶复合脂质体微囊泡的制备方法，包括制备具有荧光特性的纳米晶，该纳米晶与蛋白的氨基端通过缩合反应偶连等过程，其特征是在制备ＣｄＳｅ纳米晶的过程中，注入过量的Ｓｅ配体，对ＣｄＳｅ纳米晶的表面进行修饰，注入Ｓｅ的量比Ｃｄ多２０％～３０％，形成结构为ＣｄＳｅ／ＺｎＳｅ－ＴＯＰＯ的脂溶性ＣｄＳｅ荧光纳米晶；用反相胶束法包覆ＣｄＳｅ荧光纳米晶合成囊泡；通过改变上述囊泡溶液的ＰＨ来调节囊泡的表面电位，得到不同表面电位的囊泡。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米材料和生物
，涉及纳米生物技术，具体地说是一种用于荧光免役检测的CdSe纳米晶复合脂质体微泡囊的制备方法。
技术介绍
对于生物和生物医学检测，量子点是一种具有潜在应用价值的荧光探针，传统的荧光探针一般使用的是有机染料，有机染料作为生物检测探针，它存在着许多弊端。主要表现在有机染料所发射的荧光光谱的半峰宽是量子点发射荧光光谱半峰宽的3-5倍左右，这将带来光谱的重叠，影响检测的灵敏度，同时有机染料的激发波长要比量子点要窄，这就限制了激发光源的范围，也就是一种染料必须用一种特定波长的光激发，而量子点具有广泛的激发光谱，所以可以用一个宽范围内的光作为激发光源而能使量子点均能发射荧光。并且有机染料在光辐射下是不稳定的，一般量子点的荧光寿命大约是有机染料的20倍。对于纳米晶用于荧光免疫检测国际上最早使用的是金纳米晶，并且现在已经商品化。它的基本原理主要利用金的金属反射颜色，首先用化学溶胶-凝胶方法合成表面带有负电荷的金纳米晶，然后通过静电相互作用使这种纳米金与抗体的正电区连接。最后让这种带有抗体的纳米金通过带有抗原的层析试纸，抗体与抗原的特异性识别将抗体截住，金纳米晶聚集而显色。这种金标的探针可以满足一种抗体的检测，但是对于多种抗体同时检测是不能够实现的。量子点(主要是CdSe纳米晶)由于在达到纳米尺寸范围内，其尺寸的变化会带来发射荧光波长的改变，因此通过控制合成条件，可以得到不同尺寸的CdSe纳米晶，也就得到了在可见光范围内的发射不同波长的纳米晶，由此人们将CdSe纳米晶开发作为生物多色标记的潜在的材料，但是对于解决它与生物的相容性问题确是现在国际上所面临一难点。早在1998年，聂书明和Alivasatos就在Science上发表了将CdSe纳米晶用于生物检测的文章，前者利用CdSe纳米晶表面带的巯基乙酸的羧基端与蛋白的氨基端通过缩合反应偶连到一起，然后在Hela细胞中培养带有转铁蛋白的和不带蛋白的量子点，然后通过荧光显微镜观察，发现带有转铁蛋白的量子点被带进了细胞中，细胞中出现了量子点的荧光。同时Alivasatos也用带有表面功能团的SiO2对CdSe进行了表面修饰，再与生物连接，在检测的过程中也得到了同样的结果。但是这两种方法的缺点在于量子点在与蛋白偶连的过程中，将带来量子点和蛋白的聚集和沉降。另外，对于巯基修饰的量子点，巯基是过量的，这样蛋白在与巯基乙酸的作用过程会造成蛋白与溶液中游离的巯基乙酸结合，这会影响检测的灵敏度。接着在2000年聂又用聚苯烯小球对量子点进行了包覆，但由于聚苯烯小球在溶液中会出现溶涨问题，结果使得量子点泄露，这也限制了纳米晶的应用。因此专利技术能够有效的包覆量子点，并且具有生物相容性的复合体系是解决目前问题的关键。
技术实现思路
本专利技术通过合成高荧光特性的半导体材料，选用具有双亲集团的物质并且与生物组织相接近的磷脂类化合物对纳米材料进行包覆，目的是提供一种用于荧光免役检测的CdSe纳米晶复合脂质体微泡囊的制备方法。在结合国际上进行量子点包覆的基础上，本专利技术从两个方面来考虑这个问题，第一，合成的量子点表面带有的配体是一种疏水基团，这使得合成出的量子点必须在有机相中存在，但对于生物检测则要求合成出的量子点应转移到水相，这就涉及到相转移的过程。第二，量子点要与生物连接，那么所选用的量子点表面包覆材料必须是生物相容性的。基于这两点，本专利技术在合成高荧光特性的半导体材料的基础上，选用了具有双亲集团的并且与生物组织相接近的磷脂类化合物对纳米材料进行包覆。这种通过微乳反应的包覆一方面解决了相转移的问题，另一方面包覆之后的复合材料表面会带有很强的负电荷，这又形成了一种可直接与蛋白相连接的条件，通过静电作用可以直接将泡囊与蛋白连接到一起。本专利技术对于油相合成CdSe的纳米晶的相转移及其与生物偶连等问题提出具体的解决方案。一、制备具有高荧光特性的CdSe半导体纳米晶半导体纳米晶是由数目极少的原子或分子组成的原子或原子团簇。对于油相合成的CdSe纳米粒子，通过改变反应的实验条件可以获得不同尺寸的纳米晶，因为晶体的尺寸是与发光相关的，不同发射波长对应不同的粒子尺寸，也就是对应不同尺寸的纳米晶，因此可以在可见区内得到不同发射颜色的纳米晶。对于半导体CdSe纳米晶的合成，首先称取CdO与硬脂酸同时放入到一个反应容器中，混合搅拌并加热，生成硬脂酸镉，再将温度降至室温，使硬脂酸镉固化。另称取三辛基氧化磷(TOPO)和十六烷基胺(HDA)放入到上述反应容器中，并同时升温，在此温度下向反应容器中注入Se的配体溶液。这些是常规的合成胶体的方法，彭笑刚等在2002年已在美国化学学会杂志(JACS)发表过具体的合成方法。由于CdSe纳米晶的发光是在可见光范围内，不同尺寸的纳米晶会发出不同波长的荧光。这些使得人们致力于开发CdSe纳米晶用于生物荧光标记，这种荧光纳米晶用于荧光标记与传统的荧光染料相比具有许多的优越性，例如窄的发射波长，宽的激发波长，光化学的稳定性。但是，按上述方法合成的CdSe由于其表面有悬键，这些悬键构成了无辐射发射的中心，因此降低了CdSe发射荧光的效率。为了提高纳米晶的荧光效率，要对CdSe纳米晶的表面进行修饰。本专利技术是在传统的两步法合成核壳纳米晶的基础上，提出了一步法控制合成不同荧光效率的核壳纳米晶的方法。具体做法是在按上述方法合成CdSe纳米晶的过程中，注入的Se配体是过量的，注入Se的量比Cd多20％～30％。在完成CdSe纳米晶的生长之后，直接向体系中注入硬脂酸锌甲苯溶液。由于体系中Se是过量的并吸附在CdSe表面，当硬脂酸锌注入后，锌将直接与Se结合形成ZnSe壳层，ZnSe层抑制了无辐射发射，提高了CdSe晶体的荧光效率。对于晶体尺寸的控制，主要是利用晶体生长过程是一个吸热的过程，控制Se溶液的注入温度，并选定在注入温度之下的一定范围内的生长温度，就可以得到一系列尺寸的CdSe纳米晶，反应在光谱上是对应着不同波长的荧光光谱。它们所发射的荧光颜色主要是从兰色到红色的八种，这对于生物荧光标记是非常有意义的。具体的合成反应如下。二、制备复合有CdSe/ZnSe纳米晶的荧光囊泡为了获得生物兼容性的并且荧光可调的标记材料，需要将脂溶性的CdSe/ZnSe荧光纳米晶转移到水相，囊泡对脂溶性荧光纳米晶的包覆完成了相转移，并同时使其具有生物相溶性。囊泡的荧光性质由囊泡中纳米晶的性质及荧光纳米晶的比例所决定。本专利技术采用的是挤压法制备囊泡包覆的荧光纳米晶。挤压法合成囊泡包覆荧光纳米晶的具体步骤如下(1)首先将脂溶性的CdSe/ZnSe纳米晶与磷脂、胆固醇、高分子材料共同溶在非极性有机溶剂中，然后将混合体系用常规的方法在氮气条件下吹干，在容器表面形成薄的单层膜，单层膜需继续在通氮的条件下干燥卜2小时。所述的磷脂是电中性的卵磷脂(PC)、磷脂酰胺(PE)和带负电性如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)。在形成囊泡的过程中，磷脂是主要成分，电中性的磷脂可以单独使用，也可以将电中性的磷脂与负电性的磷脂混合使用，不同做法最终决定所形成囊泡的表面电势。胆固醇是一种中性脂质，主要作用是与磷脂相结合，阻止磷脂凝结成晶体结构。所述的高分子材料主要的作用是阻止囊泡之间的非特异性吸附，从而导致囊泡聚集。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥贵，单桂晔，冯力蕴，
申请(专利权)人：中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，
类型：发明
国别省市：