检测载脂蛋白M的免疫比浊法制造技术

本发明专利技术涉及一种检测载脂蛋白Ｍ的免疫比浊法，该检测方法用抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体，与待检标本的载脂蛋白Ｍ反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光透射强度或光散射强度表征这种变化；从载脂蛋白Ｍ标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的载脂蛋白Ｍ的含量；其中所用抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体效价至少为１∶１２８，不含杂抗体，具有识别载脂蛋白Ｍ多种抗原决定簇；待检标本是人空腹血浆或血清并用稀释剂作１∶２００～３００稀释；抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体与已稀释的待检标本的混合比为１∶４体积比。为新发现的载脂蛋白Ｍ确定了一个简便、重现性好、适应性强的检测手段，并使载脂蛋白Ｍ对临床的指导作用及进一步研究其功能提供了可能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测载脂蛋白M(Apoliprotein M，简称ApoM)的免疫比浊法，更具体讲，涉及人血浆或血清中ApoM含量的测定方法。
技术介绍
脂蛋白是在血液和其它体液中转运各种脂质的大分子复合体，参与体内多种生理、病理过程，尤其与机体脂质代谢紊乱以及心血管疾病的发生、发展有着极其密切的联系。脂蛋白有不同类型，目前主要根据物理化学性质来分类的，其中最主要的是根据超速离心时的密度分类。据此可分为乳糜微粒(CM，密度＜1.006)、极低密度脂蛋白(VLDL，密度＜1.006)、中间密度脂蛋白(IDL，1.006＜密度＜1.019)、低密度脂蛋白(LDL，1.019＜密度＜1.063)和高密度脂蛋白(HDL，1.063＜密度＜1.210)。因CM、VLDL、IDL富含甘油三酯，故统称为富甘油三酯脂蛋白(TGRLP)。血浆脂蛋白由脂类与蛋白质组分结合而成，其中的蛋白质组分被称为载脂蛋白(Apos)，有一些载脂蛋白的性质已经清楚，如ApoA-I、ApoA-II、ApoA-VI，ApoB，ApoCs和ApoE。载脂蛋白的功能有作为结合配基的受体、脂蛋白分解代谢的调节因子和/或调节脂类代谢酶的活性。某些载脂蛋白还与老年性痴呆以及调节机体免疫反应密切相关。本项专利技术的专利技术人徐宁于1999年发现了一种新型人类载脂蛋白M(ApoM)，并先后克隆了小鼠、大鼠及人的ApoM cDNA，实验发现ApoM基因存在于所有哺乳动物中，并且有着极高的同源性。初步的研究资料已经揭示ApoM可能与体内脂肪和脂蛋白代谢有关，也可能与机体脂质代谢紊乱以及机体防御反应有一定联系。最新的研究资料进一步揭示冠心病患者血浆中ApoM的水平明显高于健康志愿者。有人研究表明青年人中成年发病型糖尿病(Maturity-onset diabetes of theyoung，MODY3)病人血清中ApoM含量明显降低。综上所述，测定血浆或血清中ApoM的含量，在临床上有广泛的应用前途；同时由于ApoM是一种新近发现的蛋白，它的功能还有待进一步深入研究，在研究中，特异性强、灵敏度高、稳定性好、简便易行的测定人血浆或血清中ApoM的方法是必不可少的工具，但迄今仍未有一种适用的测定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种检测载脂蛋白M的免疫比浊法，该方法操作简单、重现性好、适应性强。实现本专利技术目的的技术方案一种检测载脂蛋白M的免疫比浊法，用抗载脂蛋白M的多克隆抗体，与待检标本的载脂蛋白M反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光透射强度或光散射强度表征这种变化；从载脂蛋白M标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的载脂蛋白M的含量；其中所用抗载脂蛋白M的多克隆抗体效价至少为1∶128，不含杂抗体，具有识别载脂蛋白M多种抗原决定簇；待检标本是人空腹血浆或血清并用稀释剂作1∶200～300稀释；抗载脂蛋白M的多克隆抗体与已稀释的待检标本的混合比为1∶4体积比。上述方法中，所述载脂蛋白M标准品是纯载脂蛋白M，其浓度为2.6g/l，先用稀释剂作1∶200稀释，再作倍比稀释，作成系列标准品，供作标准曲线用；或者是定值健康人混合血浆或血清，用酶联免疫吸附法确定其载脂蛋白M浓度，根据所定浓度，再用稀释剂调整其载脂蛋白M浓度至2.0g/l，1.5g/l及0.5g/l各一份，供作标准曲线用。上述用酶联免疫吸附法确定健康人混合血浆或血清的载脂蛋白M浓度的具体步骤是包被只抗载脂蛋白M的单克隆抗体；配制系列载脂蛋白M标准品；准备待定值的健康人混合血浆或血清；使系列标准品和待定值的健康人混合血浆或血清，同时分别与已包被的抗体结合，再使已标记的、结合位点不同于包被在96孔微孔板上的单克隆抗体同时分别与之结合，用基质液显色20～30分钟后终止显色，10分钟后测定上述系列标准品和待定值的健康人混合血浆或血清反应后的吸光度；建立系列标准品的浓度和吸光度的标准曲线并从该曲线查出待定值的健康人混合血浆或血清的载脂蛋白M的浓度，得到定值的健康人混合血浆或血清。上述方法中，所述稀释剂是由0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8gNaCl、0.5ml Tween20、40g聚乙二醇-6000，加去离子水至1000ml配制而成，用5G玻璃漏斗抽滤后备用。本专利技术检测方法的测定范围是载脂蛋白M含量在0.4g/L～2.5g/l。本专利技术的技术效果本专利技术技术方案所提供的检测方法，确定了抗载脂蛋白M的多克隆抗体必须具有的特性，还确定了它与待检标本的混合比例。由于这种抗载脂蛋白M的多克隆抗体所具有的多种抗原决定簇，为待检标本中所含载脂蛋白M提供了多个结合位点，确保二者的反应在多处发生，使反应所形成的复合物更适合用光散射强度或光透射强度的大小来表示，而且所确定的混合比例，可以确保待检标本的载脂蛋白M能完全与抗载脂蛋白M的多克隆抗体结合，因此，为新发现的载脂蛋白M建立了一种准确可行的检测方法，使载脂蛋白M对临床的指导作用及进一步研究载脂蛋白M的功能成为可能。本专利技术检测方法，操作简单；测定光透射强度或光散射强度，可采用自动化仪器，也可用手工检测仪器；作为载脂蛋白M标准品，可用纯载脂蛋白M，也可用定值健康人混合血浆或血清，因此，适用性强，特别是采用定值健康人混合血浆或血清作载脂蛋白M标准品，定值后，在-20℃以下至少可稳定半年，而且价格低于纯载脂蛋白M，因此可以降低检测费用。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步具体描述，但不局限于此。以下载脂蛋白M均简称ApoM，所用试剂均为市场采购的医用试剂，纯载脂蛋白M、抗载脂蛋白M的单克隆抗体和多克隆抗体、与抗载脂蛋白M单克隆抗体结合位点不同的抗载脂蛋白M的单克隆抗体均为专利技术人自制并可提供。一、准备ApoM标准品1、用纯ApoM作标准品将纯ApoM(2.6g/l)，先用稀释剂作1∶200稀释，再用稀释剂进一步作1∶1、1∶2、1∶4、1∶8倍比稀释，获得4种不同浓度的标准ApoM，供作标准曲线用；2、用定值健康人混合血浆作标准品采用酶联免疫吸附法确定健康人混合血浆的ApoM含量，具体步骤如下A、准备下述试剂和仪器①、包被液取1.56gNa2CO3、2.93gNaHCO3和0.20gNaN3用去离子水溶解并稀释至1000ml，其pH为9.6；②、洗液取0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8g NaCl、0.5mlTween20，加去离子水至1000ml，其pH为7.4；③、稀释液含3％牛血清白蛋白的洗液；④、基质液H2O2和四甲基联苯胺的1∶1混合物，购自R&D Systems，目录号DY999；⑤、终止液1M H2SO4；⑥、封闭液由1％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.05％的磷酸盐缓冲液混合而成；⑦、链霉亲和素-辣根过氧化物酶，购自R&D Systems，目录号DY998；⑧、酶标仪型号为Benchmark，BIO-RAD公司；⑨、96孔微孔板与蛋白质有结合能力。B、定值健康人混合血浆载脂蛋白M①、包被抗ApoM的单克隆抗体用包被液1∶1稀释抗ApoM的单克隆抗体(浓度为6.6mg/ml)，在96孔微孔板的每个孔内加100μl，每个孔内约6.6μg，室温孵育过夜，确本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测载脂蛋白Ｍ的免疫比浊法，其特征在于：用抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体，与待检标本的载脂蛋白Ｍ反应，所形成的复合物引起浊度变化；用光透射强度或光散射强度表征这种变化；从载脂蛋白Ｍ标准品的浓度与相应光散射强度或光透射强度的标准曲线查出待检标本的载脂蛋白Ｍ的含量；其中所用抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体效价至少为１∶１２８，不含杂抗体，具有识别载脂蛋白Ｍ多种抗原决定簇；待检标本是人空腹血浆或血清并用稀释剂作１∶２００～３００稀释；抗载脂蛋白Ｍ的多克隆抗体与已稀释的待检标本的混合比为１∶４体积比。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宁，
申请(专利权)人：张晓膺，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]