桔霉素免疫层析检测试纸及其制作方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种桔霉素免疫层析检测试纸及其制作方法与应用。本发明专利技术的检测试纸，包括衬垫，样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫，检测线，质控线；在衬垫上按顺序有样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫；示踪粒子结合物垫上有示踪粒子标记的抗桔霉素的抗体，硝酸纤维素膜上还设有检测线和质控线，检测线上有桔霉素检测抗原，质控线上有抗抗体，其中抗抗体是抗桔霉素的抗体的抗体。本发明专利技术的优点在于：本发明专利技术有放射免疫分析和酶联免疫吸附试验ＥＬＩＳＡ的优点。同时，本发明专利技术有简单、快速、常温保存、单份测定、一次试验测出桔霉素、除商品试剂外不需任何仪器设备的优点，特别适合桔霉素的现场快速检测。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，公开了一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法与应用。
技术介绍
桔霉素是青霉属和曲霉属的某些菌株产生的真菌毒素，于1931年首次被分离纯化。它能引起显著的肾脏毒性，并有致癌性。调查发现，一些桔霉素的产生菌在自然界分布广泛，经常引起玉米、大米等农作物的霉变。近年来，桔霉素的污染问题越来越引起人们的关注。在1991年法国里昂召开的真菌毒素和地方肾病及泌尿道肿瘤研讨会上，讨论了桔霉素在Balcan地方肾病发生中的作用，引起了国际癌症研究会的高度重视。当年，桔霉素被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。1995年法国学者Blanc证实某些红曲霉菌株也能产生桔霉素。这一发现在食品界引起了不小的震动。在此之前，红曲霉一直是作为食品生产加工的菌种来使用的。在我国，利用红曲霉发酵生产食品和药品已有上千年的历史，许多传统食品如红曲米、红曲酒和腐乳等深受人们的喜爱。现代研究还发现红曲霉的代谢产物中有许多在食品、医药和化工中很有价值的发酵产物。如品质优异、着色性好、色调丰富的天然红曲色素；能显著抑制胆固醇合成、降低血脂含量的莫那可林MonacollinK和洛伐它丁Lovastain；还有含量非常丰富的麦角固醇、长链脂肪酸及多种抗菌活物质。90年代初，欧美、日本等国对我国的食用红曲、药用红曲及其相关产品需求猛增，给我国的红曲生产厂家带来了可观的经济效益。桔霉素问题不仅使我国的红曲产品出口受到了损失，还严重地威胁到人们的健康。日本、德国等国家制定了针对我国出口的红曲相关产品的新标准，规定桔霉素的含量必须低于规定值，否则严禁进口销售。而我国的红曲产品大多达不到这些标准。面对这一严峻的形势，应尽快建立桔霉素快速检测的方法，才能保障人民健康，并挽救这一古老而年轻的食品生产行业。目前检测桔霉素的技术可分为两类，一类为色谱分析法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的真菌毒素的化学分析方法，薄层色谱由于方法灵敏度和分离效率等问题，1985年以后便很被采用，现在比较普遍的真菌毒素的分析方法还是液相色谱法，包括液相色谱-质谱联用技术，在方法适用性、分离效率和灵敏度方面，液相色谱法及液相色谱-质谱联用技术都是其他方法所无法替代的。近年来，毛细管电泳及毛细管电泳-质谱联用技术以其高分离效率也开始应用在真菌毒素分析领域并引起了广泛关注。但是由于其设备昂贵、操作复杂和对样品的纯度有较高的要求，不适合对大批量的样本进行检测，因而使用受到限制。另一类是免疫化学方法，由于对样品的纯度要求不高，并具有较高的灵敏度和特异性。特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛应用于各种真菌毒素的检测。这类方法通常包括放射免疫公析法RIA和酶联免疫分析法ELISA。RIA方法尽管具有较高的灵敏度，但由于使用了对人体有害的放射性物质，故无法推广使用。ELISA方法由于操作简单、使用安全而被普遍采用。免疫层析法是在免疫化学基础上发展起来的定性测定方法，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体，如抗体或抗原，发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域如检测带，通过酶反应或直接运用可目测的标记物，如胶体金，而得到直观的实验现象，如显色。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶、磁性颗粒等，其中运用最成功的标记物为胶体金。示踪粒子若选用常用的显色标记，当检测线、质控线正常显色，肉眼可直接分辨，若采用磁性颗粒作为示踪粒子，则需仪器判读。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法。本专利技术的另一目的在于应用该检测试纸。本专利技术的技术方案为一种桔霉素免疫层析检测试纸，包括衬垫，样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫，检测线，质控线；在衬垫上按顺序有样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫；示踪粒子结合物垫上有示踪粒子标记的抗桔霉素的抗体，硝酸纤维素膜上还设有检测线和质控线，检测线上有桔霉素检测抗原，质控线上有抗抗体，其中抗抗体是抗桔霉素的抗体的抗体。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法示踪粒子标记为如下任意一种胶体金颗粒；乳胶颗粒；胶体硒颗粒；明胶颗粒；磁性颗粒。检测原理是这样的在样品垫上滴加样品，如果样品中有桔霉素，则桔霉素经层析作用移动到示踪粒子结合物垫，与限量的抗桔霉素的抗体结合，当移动到检测线时，示踪粒子标记的抗桔霉素的抗体已无多余的结合位点与检测线上的检测抗原结合，检测线不显色或不出现磁性增强。示踪粒子标记的抗桔霉素的抗体继续向前移动到质控线，与质控线上的抗抗体反应，质控线显色或出现磁性增强。若样品中无桔霉素，则示踪粒子结合物垫上的示踪粒子标记的抗桔霉素的抗体和检测线上的检测抗原结合，检测线显色或出现磁性增强，质控线显色或出现磁性增强。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法包括如下步骤，(A)桔霉素抗原的制备，包括单克隆抗体的免疫抗原和桔霉素检测抗原的制备；(B)硝酸纤维素膜的检测线和质控线的制备；(C)示踪粒子结合物垫的制备；(D)组装试纸条。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法桔霉素抗原的制备，包括如下步骤(A)桔霉素通过活性酯法使其羧基与一同时带有羧基和氨基的小分子化合物的氨基以肽键相连，形成新的化合物。(B)该化合物再次通过活性酯法与高分子量载体物质的蛋白质、多糖、多核苷酸、多聚赖氨酸、多聚苯乙烯或其它人工合成的高分子量物质相连形成人工抗原；(C)选择桔霉素抗原的一种作为免疫抗原。(D)选择桔霉素抗原的一种作为检测抗原。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法硝酸纤维素膜的检测线和质控线的制备，包括如下步骤(A)用桔霉素检测抗原在硝酸纤维素膜上线状点样制备一条检测线；(B)用抗抗体在硝酸纤维素膜上进行线状点样制备一条质控线。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法检测线和质控线是这样制备的将硝酸纤维素膜按10-35mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-5mg/mL的桔霉素检测抗原在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm，然后在膜的顶端用浓度调整为0.01-5mg/mL的抗抗体喷涂质控线，硝酸纤维素膜4室温干燥30分钟，置于0.1-5％脱脂奶粉的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37℃孵育30分钟，置室温下干燥处密封储藏。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法示踪粒子结合物垫的制备包括如下步骤(A)用示踪粒子标记抗桔霉素的抗体，抗体包括IgG型抗体、IgM型抗体、IgA抗体；(B)把示踪粒子标记好的抗桔霉素的抗体分散在硝酸纤维素膜上。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法制备示踪粒子结合物垫的示踪粒子为如下任意一种胶体金颗粒；乳胶颗粒；胶体硒颗粒；明胶颗粒；磁性颗粒。一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法组装试纸条，步骤如下在衬垫1上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；在衬垫上加上示踪粒子结合物垫；在衬垫上加上样品垫；在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。一种桔霉素免疫层析检测试纸在检测桔霉素中的应用。本专利技术免疫层析技术检测桔霉素，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔霉素免疫层析检测试纸的制作方法，桔霉素免疫层析检测试纸，包括衬垫（１），样品垫（２），示踪粒子结合物垫（３），硝酸纤维素膜（４），吸水垫（５），检测线（６），质控线（７），在衬垫（１）上按顺序有样品垫（２），示踪粒子结合物垫（３），硝酸纤维素膜（４），吸水垫（５）；示踪粒子结合物垫（３）上有示踪粒子（９）标记的抗桔霉素的抗体（１０），硝酸纤维素膜（４）上还设有检测线（６）和质控线（７），检测线（６）上有桔霉素检测抗原（８），质控线（７）上有抗抗体（１１），其中抗抗体（１１）是抗桔霉素的抗体（１０）的抗体；其特征在于：包括如下步骤，（Ａ）桔霉素抗原的制备，包括单克隆抗体的免疫抗原和桔霉素检测抗原（８）的制备；（Ｂ）硝酸纤维素膜（４）的检测线（６）和质控线（７）的制备；（Ｃ）示踪粒子结合物垫（３）的制备；（Ｄ）组装试纸条。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许杨，刘仁荣，熊勇华，赖卫华，陈高明，
申请(专利权)人：江西中德生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]