构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型的方法及其血清检测应用技术

本发明专利技术提供一种对肝癌进行检测的非侵入性新方法：构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型及并应用于肝癌患者的血清检测。该血清蛋白质组指纹图谱模型由人血清蛋白质组质谱图谱及生物信息学－人工神经网络分析方法组成，可以应用于肝癌患者的血清学早期检测和筛查。该蛋白质组指纹图谱由五个质荷比（Ｍ／Ｚ）４０６４±２０、５１８２±２０、８８１５±２０、８９４２±２０和１４０４６±２０的蛋白质所组成。肝癌血清蛋白质组指纹图谱模型构建方法包括①血清准备；②血清标本的质谱检测和数据的收集；③质谱数据的生物信息学－人工神经网络分析。该模型能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测肝癌早期生物标志物将把肝癌的早期诊断提高到一个新的水平，其对肝癌检测的敏感性和特异度均达到９０％以上，从而为最终降低肝癌的发病率和死亡率提供了新的方法与标准。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及恶性肿瘤检测领域，为一种新的非侵入性的检测方法，利用人血清在体外对肝癌进行早期发现，早期检测，其敏感性和特异性均达到90％以上。
技术介绍
原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约发生26万例，其中42％在中国。根据卫生部的统计资料，近20年来我国每年约有11万人死于该病，在部分城市中占恶性肿瘤死亡率的第二位，部分农村居第一位。由于肝癌起病多隐匿早期症状不明显，一旦出现临床症状多已属中晚期常因此而错失治疗良机。早期发现、早期诊断、早期治疗是提高肝癌治疗效果及长期生存率的有效措施。早期诊断是在疾病的早期确定其性质、部位的过程。但肝癌早期常常没有明确的症状，病人亦不主动就诊，直至症状出现时常常已非早期。在原发性肝癌的各种治疗方法中，手术切除的疗效已得到公认。小肝癌切除后5年生存率可达50～60％；大肝癌也达到30％。然而，有80％左右的患者在发现时已经处于晚期，从而丧失了手术机会。因此，确定高危人群、寻找灵敏的筛查方法是早期发现、早期诊断、早期治疗从而改善肝癌病人预后的关键。原发性肝癌患者绝大部分伴有肝硬化，而乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染，食物中含有黄曲霉素，长期嗜酒等目前已被公认是肝癌发生的最危险因素。我国对3631例肝癌患者统计发现，其中有乙型肝炎病史5年以上占87.9％，合并肝硬化者占85.5％，HBsAg阳性者占74.8％，因此在我国，HBsAg阳性者或有慢性肝炎病史者是发生肝癌的主要高危人群。应用灵敏度高，特异度好，经济简便的方法筛选高危人群是提高肝癌患者预后的最佳方式。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是一种肝癌相关抗原，它的出现带动了肝癌诊断和治疗水平的改善，其临床价值已得到肯定。但是近年来由于存在以下原因，使得AFP诊断肝癌的价值似乎较以往有所下降1)近年来二级预防工作取得了可喜成果，越来越多的早期肝癌不断地被发现，而有大量研究表明PHC患者血清AFP含量一般与肿瘤大小呈正相关。所以这些早期肝癌常常因为肿瘤体积小而血清AFP含量不高或增高不明显，造成临床上AFP阴性肝癌病例所占的比重较前增加；2)AFP产量与肝癌细胞分化程度有关。高分化级癌细胞形态和功能与正常肝细胞相近，所以不合成或少合成AFP；低分化级的肝癌细胞由于丧失了合成AFP能力，所以血清AFP常呈阴性，只有中度分化级的肝癌细胞在形态和功能上近似胚肝细胞，因而合成AFP较多。这可能是临床上仍有部分中晚期肝癌患者血清AFP呈阴性的原因；3)随着检测方法灵敏度提高，在部分慢性肝炎和肝硬化等疾病患者血清中也可以检测出一定含量的AFP。尽管在肝炎、肝硬化病例中，AFP达到肝癌诊断标准(＞400μg/L)的不多，有报道仅约3％，但AFP升高(20μg/L)的则可高达30％，使AFP在肝癌与良性肝占位鉴别诊断的价值下降。前两者主要影响AFP诊断肝癌的敏感性，即假阴性增加；而后者则主要影响其特异性，即假阳性增加。由于AFP存在上述缺点，使得其在肝癌的血清学诊断价值受到了一定的限制。显然，寻找出比AFP更敏感，更特异的肝癌特异性指标成为目前迫在眉睫的问题。20多年来肝癌其他标志物的研究曾十分活跃，都希望能找到一个可靠的标志物弥补AFP的不足。文献报道较多的有γ2谷胺酰转肽酶同工酶II(GGT II)，异常凝血酶原(DCP)，α2L2岩藻糖苷酶，α12抗胰蛋白酶及5′2核苷酸磷酸二酯酶同工酶V等。可惜这些标志物大多特异性不高。目前除GGT II、DCP等尚有应用外，其余已少问津。20世纪80年代发现AFP糖链结构在肝癌与肝炎中有所不同，可藉植物凝集素亲和电泳法加以区别，使用较多的如小扁豆凝集素(LCA)亲和电泳法，即AFP异质体的检测，若LCA结合型AFP＞25％，则可提示为肝癌产生的AFP，对肝癌与肝炎的鉴别诊断有一定的作用。惟此法检测仅适用于AFP浓度较高的患者。AFP单克隆抗体的检测虽可用于AFP低浓度患者，但方法较为复杂而未能广泛应用。人类基因组学和蛋白质组学的发展，为肿瘤诊断提供了新的思路和手段。蛋白质组学是现代科技前沿，通过对蛋白质动态的分析可以探察出疾病早期最微小的指标和征兆。而实现这种诊断，首先要找出各种疾病的特殊标志分子，其次需要有适合于临床诊断的仪器设备。目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术，例如双向电泳、质谱。双向电泳是一种癌症早期鉴别肿瘤标记物的新方法。双向凝胶电脉虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术，并在技术上已有了很大的改进，使其重复性和灵敏度大大提高，但这种方法不适于大规模的普查或临床检验，因为它是一种费时、费力，而且在实验室很难标准化的方法，无法将其做大量样品的常规分析。质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而无法实现高通量的蛋白质分析。美国Ciphergen公司研发的基质辅助激光解析离子化系统(SELDI)集分离纯化和质谱检测于一身，这种技术是利用经过特殊处理的固相支持物或芯片的基质表面，根据蛋白质物理、化学性质的不同，选择性地从待测生物样品中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质表面上，经原位清洗和浓缩后，结合TOF-MS技术，对结合的多肽或蛋白质进行质谱分析。质谱分析的原理是利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解吸形成荷电离子，根据不同质荷比这些离子在仪器中飞行的时间长短不一，由此绘制出一绕质谱图来。该图经计算机软件外理还可形成模拟谱图，宇数据库中的谱图进行对照，我们还能够最终发现和捕获新的疾病异性相关蛋白及其特征。整个测定过程一般可以在几分钟内就全部完成，十分迅速，同时不会破坏所测定的蛋白质。该技术除具有质谱在分辨率和灵敏度方面的特别优势外，它还可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测。其最新型号的仪器已经实现了检测的自动化，每天可以进行近千次的标本检测，从而提供了适合于临床检验的蛋白质组研究工具。SELDI进行蛋白质测定所使用的是一种新的蛋白质芯片技术，实际上是蛋白质芯片和质谱技术联用的蛋白质谱分析平台，其核心是一系列称为Protein chip的蛋白质芯片。蛋白质芯片是以色谱原理设计的蛋白芯片，该芯片由金属铝制成，其长度为8厘米，宽度为1厘米，上面刻有8个直径2毫米的芯片点，其上覆盖有不同性质的介质。根据芯片表面介质的不同化学成分，可将其分为化学表面芯片和生物表面芯片。其中化学表面芯片又可分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯合芯片五种，用于检测未知蛋白，并获取蛋白质表达图谱；生物表面分为抗体-抗原、受体-配体和DNA-蛋白质芯片等种类，可显示与之相结合的抗原或配体的不同分子量亚型。蛋白质芯片相当于在质谱分析前增加了一步色谱分离。在检测过程中使用不同类型的芯片对同一样品进行检测可以获得完全不同的结果，原因相当于采用了不同的分离方法处理样品。SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片阵列结合，就可通过电离——解吸飞行时间——质谱仪检测，并根据蛋白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质(保留在芯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建肝癌蛋白质组指纹图谱模型的方法及其在肝癌患者血清检测中的应用，其特征是：该血清蛋白质组指纹图谱模型由人血清蛋白质组质谱图谱及生物信息学－人工神经网络分析方法组成，可以应用于肝癌患者的血清学早期检测和筛查。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱林，
申请(专利权)人：郭爱林，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]