一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I、其编码序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种在马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）正常细胞壁中表达的新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原Ｉ及其编码序列，本发明专利技术还提供了该细胞壁表面抗原蛋白及其核酸的制备方法及其应用。用该抗原免疫小鼠成功地制备了对应的单克隆抗体，并经筛选得到了特异性好、亲和力高的多株单克隆抗体，同时建立双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测抗原，可应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子免疫学、分子生物学、生物信息学和基因工程等领域，具体地，本专利技术涉及一种马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)细胞壁表面抗原I及其编码序列。本专利技术还提供了该细胞壁表面抗原I及其核酸序列的制备方法和应用。
技术介绍
真菌基因组研究始于二十世纪九十年代，第一个完成全基因组测序的真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在过去的几年里，FGI(Fungal Genome Initiative)委员会从150多万种真菌中，选取了15个在医药和工农业中具有重要价值的物种进行了基因组学的研究。2003年6月，FGI委员会新增了44个物种，其中包括了马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南从一只中华竹鼠的肝脏分离出来的一种青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并没有引起人们的注意。1973年Disalvo在美国南卡首次发现人自然感染的病例，患者是一位曾在东南亚旅行过的传教士。1964年邓卓霖在广西一土生农民身上发现此菌，但当时全世界都还没有此病报导，故将其认定为荚膜组织胞浆菌。1984年邓卓霖在国内首例报导了一例马尔尼菲青霉病。从1984年到1987年，广西医科大学病理科收集的19全身播散型病例中，有4例发现有导致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺发育不良，SLE(系统性红斑斓创)，TB(结核)等。1999年，邓卓霖首先发现了国内第一例合并AIDS的患者。近几年国内新发现的病例中，合并AIDS的患者越来越多。泰国至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年来发现70-80％的AIDS的患者后期感染上马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌多呈条件致病菌，25℃呈丝状真菌，为非致病菌；37℃呈酵母形态，为致病菌。它是一种深部致病真菌。它侵犯人体的单核巨噬系统，破坏人的免疫系统，使人体的免疫力下降。由于它在局部的机械破坏作用，以及代谢产物，毒素等作用，产生炎症反应，导致浓肿，肉芽肿等改变。并容易破坏血管进入血液循环，导致败血症。进入人体的途径一般是呼吸道或皮肤。马尔尼菲青霉菌是300余种青霉菌中唯一的双相致病菌(Borneman AR，etal.2000)。随着AIDS在全世界范围的蔓延，马尔尼菲青霉菌引起的急性系统性或播散性感染明显增加，已成为影响未来公众健康的潜在机会性致病菌(Ungpakorn R.2000)。马尔尼菲青霉病病情凶险，若不及时治疗，死亡率可高达91.3％(Sirisanthana R，et al.1998)。如果能早期诊断，早期抗真菌治疗对此病是有效的(Sirisanthana R，et al.1998)。但因其临床表现复杂且无特异性，误诊率极高。目前对马尔尼菲青霉感染诊断主要依靠分离培养及组织病理学检查。但分离培养耗时长，阳性率低，且易污染造成假阳性结果。组织活检病理学发现特征性酵母样细胞对诊断有重要价值，但极易与荚膜组织胞浆菌及隐球菌感染相混淆。国外学者采用免疫组化方法鉴定马尔尼菲青霉感染(Arrese E J，et al.1992)，敏感性较低，而且实验耗时长。Desakorn等(1999)制备荧光标记抗体并采用ELISA方法检测马尔尼菲青霉，敏感性高，但由于是多克隆抗体，易出现交叉反应。目前国内尚无一种检测马尔尼菲青霉抗原快速、敏感性高、特异性强的方法。我们经研究发现了一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I，用该抗原免疫小鼠成功地制备了对应的单克隆抗体，并经筛选得到了特异性好、亲和力高的多株单克隆抗体，同时建立双抗体夹心ELISA法检测抗原，应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I、其编码序列及该细胞壁表面抗原的应用。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的在本专利技术的一个方面，提供了一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。较佳的，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。或者较佳的，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。较佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。在本专利技术的再一方面，提供了一种载体，所述载体含上述分离出的多核苷酸。在本专利技术的再一方面，提供了一种遗传工程宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。本专利技术还提供了一种生产马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法，该方法包括如下步骤(I)将编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成抗原表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)将步骤(I)中的表达载体转入宿主细胞，形成马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I重组细胞；(III)在适合表达马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I多肽的条件下，培养步骤(II)中的重组细胞；(IV)分离出马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽。较佳的，上述生产马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的多肽的方法中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸31-693位的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种抗体，所述抗体是能与上述马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I特异性结合的抗体。本专利技术还包括一种探针分子，该探针分子通常含有马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针分子可用于检测样品中是否存在编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核酸分子。本专利技术还提供了含所述的多肽或其连续片段的药物组合物及疫苗组合物。本专利技术还提供了所述的多核苷酸、多肽、抗体及疫苗在制备诊断和治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物及试剂盒中的应用。本专利技术还提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗体或它们的连续片断的试剂盒及生物芯片。本专利技术还提供了双抗体夹心ELISA法检测所述抗原，应用于临床快速诊断马尔尼菲青霉病。本专利技术还包括检测马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原I的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌细胞壁表面抗原Ⅰ的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：ａ）与编码含有ＳＥＱＩＤＮＯ．２的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有 至少７０％同源性的多核苷酸，ｂ）编码含有与ＳＥＱＩＤＮＯ．２的氨基酸序列至少７０％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，ｃ）与ａ）或ｂ）的多核苷酸互补的多核苷酸，以及ｄ）含有ａ）、ｂ）或ｃ）的多核苷酸序列的至少 １５个连续碱基的多核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卜云萍，任双喜，汤生荣，殷世亮，严中华，李运千，施炜亮，武金炜，钱震，卢凌峰，张丕燕，许彬，沈欢，
申请(专利权)人：上海人类基因组研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]