一种新的马尔尼菲青霉菌ERG25基因及其编码蛋白制造技术

本发明专利技术提供了一种在马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）正常细胞膜中表达的新的马尔尼菲青霉菌ＥＲＧ２５基因及其编码蛋白，本发明专利技术还提供了该ＥＲＧ２５基因及其蛋白的制备方法和应用。马尔尼菲青霉菌中的ＥＲＧ２５基因编码Ｃ－４位固醇甲基氧化酶，作用是脱去Ｃ－４位的两个甲基，在合成真菌细胞膜主要成分的麦角甾醇中起着关键作用。ＥＲＧ２５基因抑制因子的机理与吡咯的作用机制相似，这种抑制机制在开发和应用用于在生合成麦角固醇Ｃ－４位固醇去甲基化具有靶向作用的抗真菌化合物有重要的意义。同时ＥＲＧ２５抑制过程可被应用于在固醇生合成酶促反应的整个过程的调控和利用其它真菌中的固醇类物质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子免疫学、分子生物学、生物信息学和基因工程等领域，具体地，本专利技术涉及一种在马尔尼菲青霉菌细胞膜中表达的ERG25基因及其编码的氨基酸序列。本专利技术还涉及该基因核酸序列和蛋白的制备方法及其用途。
技术介绍
真菌基因组研究始于二十世纪九十年代，第一个完成全基因组测序的真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在过去的几年里，FGI(Fungal Genome Initiative)委员会从150多万种真菌中，选取了15个在医药和工农业中具有重要价值的物种进行了基因组学的研究。2003年6月，FGI委员会新增了44个物种，其中包括了马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南从一只中华竹鼠的肝脏分离出来的一种青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并没有引起人们的注意。1973年Disalvo在美国南卡首次发现人自然感染的病例，患者是一位曾在东南亚旅行过的传教士。1964年邓卓霖在广西一土生农民身上发现此菌，但当时全世界都还没有此病报导，故将其认定为荚膜组织胞浆菌。1984年邓卓霖在国内首例报导了一例马尔尼菲青霉病。从1984年到1987年，广西医科大学病理科收集的19全身播散型病例中，有4例发现有导致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺发育不良，系统性红斑斓创(SLE)，结核(TB)等。1999年，邓卓霖首先发现了国内第一例合并AIDS的患者。近几年国内新发现的病例中，合并AIDS的患者越来越多。泰国至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年来发现70-80％的AIDS的患者后期感染上马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌多呈条件致病菌，25℃呈丝状真菌，为非致病菌；37℃呈酵母形态，为致病菌。它是一种深部致病真菌。它侵犯人体的单核巨噬系统，破坏人的免疫系统，使人体的免疫力下降。由于它在局部的机械破坏作用，以及代谢产物，毒素等作用，产生炎症反应，导致浓肿，肉芽肿等改变。并容易破坏血管进入血液循环，导致败血症。进入人体的途径一般是呼吸道或皮肤。胆固醇生合成途径是类异戊二烯途径的重要分支并且对细胞内的一些其他的化合物有着重要的作用。在合成固醇的过程中，需要真核细胞膜上的一些原料，最初的固醇前体物质(如动物和真菌体内的羊毛甾醇和植物中的环阿乔醇)在转化为最终固醇产物之前要经历3次去甲基化。在羊毛固醇和环阿乔醇的第一次去甲基化直接发生在碳14位的甲基上。真菌的去甲基化是ERG11基因编码的产物所催化的。剩下的去甲基化发生在连续的脱去C-4位的两个甲基，形成酵母甾醇，最后形成麦角甾醇。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要成分。在固醇的生合成途径的损伤所导致的固醇营养缺陷型是抗真菌类药物发展和应用的良好方向。在固醇的生合成途径中有很多的阻遏物(2.Lees，N.D.，Skaggs，B.，Kirsch，D.R. & Bard，M.(1995)Lipids 30，221-226.)，如吡咯类抗真菌类药物的广泛用途在人们的健康方面是非常重要的(3.VandenBossche，H.，Willemsens，G.&Marichal，P.(1987)Crit.Rev. Microbiol.15，57-72.)。ERG11基因产物，细胞色素P450羊毛固醇14a去甲基酶，指示了吡咯类抗真菌类药物作用的靶位点。这类药物已经成功的用于假丝酵母以及其它致病性真菌所引起的局部的和全身的感染。最近真菌感染致病率的上升是由于化疗药物的大量应用(4.Georgopapadakou，N.H. & Walsh T.J.(1994)Science 264，371-373.)，侵害性手术技术，器官移植技术，以及疾病状态所影响的机体免疫力下降所导致的对吡咯类抗真菌类药物应用增加所产生的耐药性(5.Hitchcock，C.A.(1993)Biochem.Soc.Trans.21，1039-1047.6.Venkateswarlu，K.，Denning，D.W.，Manning，N.J. & Kelly，S.L.(1995)FEMS Microbiol.Lett.131，337-341.)。ERG25基因编码C-4位固醇甲基氧化酶，这个酶的作用是脱去C-4位的两个甲基，并且去甲基化的过程专一的发生在C-4a甲基上，经历了甲基氧化为醇羟基、醛基，最后氧化成羧酸，这个连续的氧化反应需要NADH和氧气以及细胞色素b5在NADH和氧化酶之间作为电子的载体。ERG25基因抑制因子的机理与吡咯的作用机制相似，这种抑制机制在开发和应用用于在生合成麦角固醇C-4位固醇去甲基化具有靶向作用的抗真菌化合物有重要的意义。同时ERG25抑制过程可被应用于在固醇生合成酶促反应的整个过程的调控和利用其他真菌中的固醇类物质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种新的马尔尼菲青霉菌ERG25基因。本专利技术的另一目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为ERG25蛋白，该蛋白具有C-4位固醇甲基氧化酶活性。本专利技术的再一个目的是提供一种生产所述的新的马尔尼菲青霉菌ERG25蛋白的方法。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的在本专利技术的一个方面，提供了一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码ERG25基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。所述多肽优选具有C-4位固醇甲基氧化酶活性。较佳地，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。或者较佳地，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸45-944位的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。更佳地，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸45-944位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离的蛋白多肽，所述多肽具有与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。较佳地，所述多肽是具有SEQ IDNO.2序列的多肽。在本专利技术的再一方面，提供了一种载体，所述载体含有上述分离出的多核苷酸。在本专利技术的再一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。较佳地，所述宿主细胞是大肠杆菌或者所述宿主细胞是酵母。在本专利技术的再一方面，提供了一种产生具有C-4位固醇甲基氧化酶活性的ERG25蛋白多肽的方法，该方法包括如下步骤(I)将编码具有ERG25蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成ERG25蛋白表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）的分离的多核苷酸，其含有编码ＥＲＧ２５基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：ａ）与编码含有ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．２的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少７０％同源 性的多核苷酸，ｂ）编码含有与ＳＥＱＩＤＮＯ．２的氨基酸序列至少７０％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，ｃ）与ａ）或ｂ）的多核苷酸互补的多核苷酸，以及ｄ）含有ａ）、ｂ）或ｃ）的多核苷酸序列的至少１５个连续碱基 的多核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卜云萍，任双喜，钱震，殷世亮，严中华，施炜亮，
申请(专利权)人：上海人类基因组研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]