本发明专利技术提供了一种在马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）正常细胞膜中表达的新的马尔尼菲青霉菌Ｃ－２２固醇脱氢酶（ＥＲＧ５）基因及其编码蛋白，本发明专利技术还提供了该ＥＲＧ５基因及其蛋白的制备方法和应用。马尔尼菲青霉菌中的ＥＲＧ５基因编码Ｃ－２２固醇脱氢酶（Ｃ－２２ ｓｔｅｒｏｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ），此酶是形成固醇侧链Ｃ－２２（２３）双键所必需的。利用本发明专利技术的马尔尼菲青霉菌Ｃ－２２固醇脱氢酶（ＥＲＧ５）基因及其编码蛋白，可以制备抗真菌化合物，也可为进一步开发针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物提供重要的参考价值，同时，它们也可以作为这类疾病诊治的潜在药物靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子免疫学、分子生物学、生物信息学和基因工程等领域，具体地，本专利技术涉及一种在马尔尼菲青霉菌细胞膜中表达的C-22固醇脱氢酶(ERG5)基因及其编码的氨基酸序列。本专利技术还涉及该基因核酸序列和蛋白的制备方法和用途。
技术介绍
真菌基因组研究始于二十世纪九十年代，第一个完成全基因组测序的真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在过去的几年里，FGI(Fungal Genome Initiative)委员会从150多万种真菌中，选取了15个在医药和工农业中具有重要价值的物种进行了基因组学的研究。2003年6月，FGI委员会新增了44个物种，其中包括了马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南从一只中华竹鼠的肝脏分离出来的一种青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并没有引起人们的注意。1973年Disalvo在美国南卡首次发现人自然感染的病例，患者是一位曾在东南亚旅行过的传教士。1964年邓卓霖在广西一土生农民身上发现此菌，但当时全世界都还没有此病报导，故将其认定为荚膜组织胞浆菌。1984年邓卓霖在国内首例报导了一例马尔尼菲青霉病。从1984年到1987年，广西医科大学病理科收集的19全身播散型病例中，有4例发现有导致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺发育不良，SLE(系统性红斑斓创)，TB(结核)等。1999年，邓卓霖首先发现了国内第一例合并AIDS的患者。近几年国内新发现的病例中，合并AIDS的患者越来越多。泰国至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年来发现70-80％的AIDS的患者后期感染上马尔尼菲青霉菌。马尔尼菲青霉菌多呈条件致病菌，25℃呈丝状真菌，为非致病菌；37℃呈酵母形态，为致病菌。它是一种深部致病真菌。它侵犯人体的单核巨噬系统，破坏人的免疫系统，使人体的免疫力下降。由于它在局部的机械破坏作用，以及代谢产物，毒素等作用，产生炎症反应，导致浓肿，肉芽肿等改变。并容易破坏血管进入血液循环，导致败血症。进入人体的途径一般是呼吸道或皮肤。固醇是真核生物细胞膜的特有而重要的组成成分，在调节流动性和渗透性方面起着重要的结构性作用(Annu.Rev.Microbiol.49，95-116)。麦角固醇(ergosterol)在结构和功能上与哺乳动物细胞中的主要固醇胆固醇相似，是真菌中主要的固醇。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中固醇的生物合成途径被深入的阐述，至少25种已知酶参与麦角固醇的合成(Yeast 14，1471-1510)。Skaggs et al，(1996)克隆并测序了ERG5基因，确证ERG5基因编码C-22脱氢酶。C-22脱氢酶是参与酵母固醇生物合成的第二个CyP450。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，生物膜上的固醇(sterols)调节膜的流动性、渗透性、膜结合生物酶的活性和生长率，起着重要的生物学作用。一些研究者发现固醇可能起着一种激素或者说“火花”的功能，因为极低水平的某些特定固醇是生命活动所必须的(Rodriguez and Parks，1983；Ramgopal and Bloch，1983)。通过系统的方式，许多麦角固醇生物合成中的基因被克隆出来并且在不影响生长的情况下被破坏(Lees et al.，1995)。ERG5基因编码C-22固醇脱氢酶(C-22 sterol desaturase)，此酶是形成固醇侧链C-22(23)双键所必需的。这一脱氢侧链只在植物和真菌中被发现，而动物细胞中包含的胆固醇拥有一条充分饱和的侧链。Molzahn和Woods(1972)通过对多烯抗生素制霉菌素抗性实验率先描述了酵母C-22固醇脱氢酶基因的一个突变(erg5-1)。Barton et al.(1974)发现ergosta-5，7-dien-3β-ol而不是麦角固醇(ergosta-5，7，22-trien-3β-ol)作为主要的固醇累积。Lees et al.(1980)证实，当生长在多种碳源上，暴露于去污剂或高浓度阳离子的情况下，erg5的突变株相对于erg2，erg3，erg6的突变株，显示的表型与野生型细胞的更相似。Kalb et al.(1986)克隆并测序了ERG11基因，进一步证实通过细胞色素P-450(CyP450)羊毛甾醇发生去甲基化(Aoyama and Yoshida，1978)。Hata etal.(1981)证实C-22固醇脱氢步骤被CyP450的抑制剂一氧化碳、铁氰化物、甲吡酮细胞色素c等抑制，而不能被氰化物或叠氮化物抑制。Hata et al.(1983)进一步证实羊毛甾醇14α-脱氢酶CyP450不能在固醇侧链C-22位置脱氢。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的马尔尼菲青霉菌C-22固醇脱氢酶(ERG5)、其编码序列及其应用。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的在本专利技术的一个方面，提供了一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码ERG5基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。所述多肽优选具有C-22固醇脱氢酶活性。较佳地，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。或者较佳地，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸51-1655位的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。更佳地，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸51-1655位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离的蛋白多肽，所述多肽具有与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。较佳地，所述多肽是具有SEQ IDNO.2序列的多肽。在本专利技术的再一方面，提供了一种载体，所述载体含有上述分离出的多核苷酸。在本专利技术的再一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。较佳地，所述宿主细胞是大肠杆菌或者所述宿主细胞是酵母。在本专利技术的再一方面，提供了一种产生具有C-22固醇脱氢酶活性的ERG5蛋白多肽的方法，该方法包括如下步骤 (I)将编码具有C-22固醇脱氢酶活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成ERG5蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸51-1655位的核苷酸序列有至少70％同源性，较佳地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸51-1655位的核苷酸序列；(II)将步骤(I)中的表达载体转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自马尔尼菲青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）的分离的多核苷酸，其含有编码Ｃ－２２固醇脱氢酶（ＥＲＧ５）基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：ａ）与编码含有ＳＥＱＩＤＮＯ．２的氨基酸序列的多肽的多核苷 酸有至少７０％同源性的多核苷酸，ｂ）编码含有与ＳＥＱＩＤＮＯ．２的氨基酸序列至少７０％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，ｃ）与ａ）或ｂ）的多核苷酸互补的多核苷酸，以及ｄ）含有ａ）、ｂ）或ｃ）的多核苷酸序列的 至少１５个连续碱基的多核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤生荣，任双喜，卜云萍，严中华，殷世亮，李运千，施炜亮，武金炜，卢凌峰，
申请(专利权)人：上海人类基因组研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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