核酸分析方法、分析装置及分析用盘片制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种可在随移动所需的经过时间进行反应的流式反应中，在流路的多个测定点同时连续、且不间断地对反应样品的状态变化进行光学测定的方法或结构体。使含有核酸的分析用样品流入流路，利用控制通过区域温度的温度控制装置使该流路的温度以重复模式改变，在流路中流动的含有核酸的分析用样品的状态变化，在流路的多个部位利用光学检测装置进行检测。该流路可设置于被旋转驱动的盘片上的样品分析区域，并可利用相对地设置在该核酸分析用盘片上的光信息检测装置对流路内反应样品溶液的信息进行同时连续且不间断地检测。还可提供一种紧凑型核酸分析用装置，在该结构体的结构中具有含核酸的分析用样品的流式反应管与光学检测装置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸分析方法、分析装置及分析用盘片，该分析方法为使含核酸的分析用样品流过以重复模式改变温度的流路，并以光学方法检测样品中经PCR扩增的核酸浓度等。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)法为选择性扩增样品中微量存在的特定DNA的方法，通过此方法扩增的DNA可作为单一的化学物质进行分析或利用。分析和利用由此分离的DNA的技术不仅被应用于科学研究和医疗领域，也被广泛应用于全体工业界。作为应用PCR方法的分析方法，已知的实时(real time)PCR方法为通过PCR选择性扩增作为定量目标的DNA、并基于得到的扩增曲线间接测定样品中所含DNA的最初含量的方法。该方法伴有利用逆转录酶由具有特定序列的RNA定量合成互补DNA的反应，因而也作为测定样品中RNA量的方法进行利用。实时PCR方法被广泛用作具有可重复性、提高了定量性的测定方法，并且也用作无需繁琐操作的简便的DNA或RNA定量方法。其应用领域并非局限于核酸浓度测定法，也被用作有效检测及鉴定基因多态性的方法，所谓基因多态性已知为人类基因的单核苷多态性(SingleNucleotide Polymorphism；SNP)，使与疾病相关的基因功能产生个体差异。不局限于PCR，比较慢的反应也可利用简单的方法对其发展过程进行经时追踪。即，在反应过程中从反应容器内取出部分样品，通过对取出的样品进行逐一分析以追踪该反应的发展过程的方法；或在多个容器中分别注入同一反应液，使这些容器分别处于同一反应条件下，并在特定时刻逐一停止不同容器中的反应，以此获得同一反应的时间系列样品，并对该时间系列的样品进行逐个分析以追踪该反应进行过程的方法。但前一种方法需要进行取样，后一种方法不能在同一容器中进行分析，两者都不能在封闭的体系中检测最初至最后的反应过程。另外，被取样、测定的样品也无法用于其后的反应。为得到实时PCR方法中定量所需的DNA扩增曲线，必须对反应进行过程进行经时追踪以获得反应样品溶液中与DNA含量相关的信息，此时，为提高定量性、反应体系的稳定性、测定装置的简易性等，优选在整个反应过程中保持反应体系的同一性和同质性，另外，还优选尽量减少必需的反应样品溶液量。因此，期望不采用上述的简单方法，而是使最初至最后的反应全过程在密闭的体系中进行，关于此问题，例如在专利文献1及2中作为用于由荧光监测DNA扩增的系统和方法，公开了可在监测反应进程的同时迅速控制PCR样品的装置。根据PCR方法的原理，可将PCR的1个全反应过程分为3个阶段进行说明。即，作为目标的模板DNA解离为单链DNA的过程；此单链DNA与寡聚核苷酸(引物DNA)形成双链结构的过程，该寡聚核苷酸具有可与从模板DNA中选择的特定序列形成双链的能力；以及以形成了双链的引物DNA的末端部分作为起始点的DNA延长反应过程。通过使反应样品溶液处于最适合各反应过程的温度下来依次进行上述三阶段的反应，也可将此温度循环定义为PCR温度循环。通过重复PCR温度循环进行DNA的复制合成，使目标DNA以指数函数扩增。由此，由于PCR产物的扩增倾向特性与样品中含有的DNA的最初量密切相关，因此优选在每个PCR温度循环中，反应达到平台期(plateau)后进行测定。关于此问题，例如，除了专利文献1及2，还在专利文献3中公开了一种装置，该装置可在使用空气作为导热介质的快速热循环中添加生物学样品。另外，在专利文献4中公开了一种采用流式PCR的方法及装置。在采用通常方法的PCR中，反应样品溶液被固定在1个反应容器内，并处于经时PCR温度循环中。与此相反，在流式PCR方法中，反应样品溶液在毛细管内沿流路移动，并且，该毛细管被配置成沿流路与反复改变温度的导热作用体物理性接触。即，通过使此毛细管沿流路与反复改变温度的导热作用体进行物理性接触，使以限定流速在毛细管内的空间中移动的反应样品溶液基于移动所需的经过时间被赋予PCR必须的温度循环。因此，在流式PCR中对反应样品溶液赋予PCR温度循环的方法与通常的方法不同，因此不能使用现有的PCR装置来构造该装置的基本结构。因此，期待提供一种可在产业中廉价使用、并且可信性高的流式PCR装置。为了使上述流式PCR之类将毛细管作为反应管的反应测定装置具有紧凑结构，期望将反应管固定于任一种基板上，并且，希望将该类毛细管内的反应体系与可通过光学检测装置直接观察反应样品溶液中含有物质量的变化的检测体系一同构成。作为此类结构，在专利文献5中公开了一种结构，该结构在盘状基板上从该盘片中心呈放射状地形成多条流路，通过旋转该盘片使形成放射状的多条流路依次在一个检测系统中进行测定。另外，专利文献6中还公开了一种装置及方法，该装置用于在机器内搭载的具有信息科学的超微量液体元件工学系统中，利用向心加速推进液体移动。专利文献1特表2000-512138号公报专利文献2特表2000-509608号公报专利文献3特表2000-511435号公报专利文献4特开平6-30776号公报专利文献5特表2003-149253号公报专利文献6特表2002-503331号公报
技术实现思路
如上述说明所述，在目前的PCR方法中，反应样品溶液固定于1个反应容器中，处于经时重复的PCR温度循环内。此时，在逐次经时进行的反应过程中，反应初期阶段观察到的信息不能通过观察进行至反应后期阶段的同一反应体系来获得。因此在目前的实时PCR方法中，关于反应进行过程中的反应样品溶液中的DNA量的信息，是通过与该反应体系的进程同步发挥功能的检测系统进行测定的。通常，该类检测系统中，预先在反应试样溶液中混合可通过与双链DNA结合而增大荧光强度的荧光色素，将其作为在PCR进行过程中直接或迅速地进行应答的检测用试剂使用，相反，难以利用间接或缓慢应答的该类检测用试剂。另外，在PCR方法中，DNA在上述说明的每个PCR温度循环中进行复制，为进行可忠实反映其扩增效率的测定，以适当的时机检测在PCR温度循环中动态形成的双链DNA-荧光色素复合物是很重要的。最佳时机根据样品、模板DNA量、引物、温度循环等PCR条件不同而各异，并且也根据每个PCR温度循环不同而不同，但目前的PCR中，如上所述，由于采用逐次经时进行的反应体系，因此无法将获得的信息反馈至反应体系或检测系统而加以利用。并且，也无法在反应进行后测定几种不同的性质。上述专利文献1、专利文献2、专利文献3中公开的实时PCR的方法及装置利用现有的PCR方法，不是从本质上解决上述问题的技术。与此相反，流式PCR的方法中，如上所述，反应样品溶液在流路的空间中移动，基于移动所需的经过时间赋予PCR温度循环。此时，存在于从流路的起点至终点的各不同距离的反应样品溶液，对应于其距离，成为PCR整个反应过程中从初期到后期的各个不同反应阶段的反应样品溶液。因此，通过在多个部位观察稳态移动的PCR反应样品溶液，可以在同一时间观察到在流路中进行的PCR反应过程。通过利用在实时PCR中组合具有此类特征的流式PCR方法得到的流式实时PCR，不必利用能够与该反应的进程同步发挥功能的检测系统测定有关反应进行过程中反应样品溶液中的DNA量的信息，可以消除如上述说明的缺点。另外，在作为测定装置使用时，当反应体系和检测系统及连接它们的控制系统的任一功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分析方法，其特征为，使含有核酸的分析用样品流入温度以重复模式改变的流路，在所述流路的多个部位进行光学检测。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：楸原直人，石黑隆，
申请(专利权)人：太阳诱电株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]