涉及Ｇ－蛋白偶联受体寡聚体的材料和方法技术

本发明专利技术提供了涉及Ｇ－蛋白偶联受体（ＧＰＣＲ）寡聚体的材料和方法。本发明专利技术提供了与Ｇ－蛋白结合的两种或多种ＧＰＣＲｓ的复合物。本发明专利技术还提供了包括ＧＰＣＲ和Ｇ－蛋白的融合蛋白、核酸、表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还提供了生产本发明专利技术复合物和融合蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与G-蛋白偶联受体(GPCR)寡聚体相关的材料和方法。本专利技术特别，但不限于提供了包括GPCR寡聚体的生物学试剂、生产所述生物学试剂的方法和用于测定其功能的试验。本专利技术还提供了用于测定具有调节GPCR寡聚体，特别是杂-寡聚体功能的能力的化合物的试验。
技术介绍
GPCR是人类基因组中最大的基因家族之一且已经成为用于研发临床有效的小分子药物的最易于控制的一组靶物。据估计在临床用于人的药物中约有40％以GPCR为靶。由此对GPCR的结构、调节和活化机制以及它们控制的下游信号级联放大的详细情况存在巨大关注。A类或视紫红质类家族的GPCR是迄今为止含有80％以上总GPCR家族成员的最大类。已经在人类基因组测序程序中鉴定了800个以上编码GPCR的基因，但它们中仅有约25个目前成为临床有效药物的靶物。因此，对此进行发展并找到靶向目前鉴定的GPCR的有用药物有巨大潜力(Lee等，2001)。在最近的过去，GPCR作为二聚体存在的概念已经从假说迅速发展成显然被接受(参见Bouvier，2001，Milligan，2001，George等，2002综述)。尽管均二聚体(即含有一个单个GPCR的两个拷贝的二聚体)已经得到了最佳研究，产生的证据提示既发生杂二聚化(即二聚体由两个不同的GPCR各自的一个分子组成)，又可以具有功能性和药理性后遗症(Devi，2001，George等，2002)。然而，与形成这类杂二聚体的选择性和在共表达两种不同GPCR还必然导致均二聚体对产生时如何在分离中监测杂二聚体的功能相关的重要问题仍然存在。假定在单个细胞中共表达许多GPCR，则很可能细胞中GPCR二聚体的补体为复杂的。已经对γ-氨基丁酸(GABA)B型受体(GABABR)进行了研究(Duthey等，2002)。这是一种罕见的GPCR，因为迄今为止已知它是唯一一种需要两个亚单位GB1和GB2起作用的受体。GB1亚单位含有GABA结合位点，但不能单独活化G-蛋白。GB2不结合GABA，但确实具有活化G-蛋白的能力。Duthey等考虑了G-蛋白偶联中GB1-GB2杂聚体(heteromer)内每一种亚单位的作用。该研究包括将突变引入GB1和GB2，特别是在第3胞内环内。他们确定使GB2突变防止了G-蛋白活化，而使GB1发生相似的突变不会影响受体功能。尽管关注GABAB受体，但是这项研究令人遗憾地没有提供任何有关GPCR的信息，其中相同蛋白质既能使配体结合又能使G-蛋白活化。其它研究着眼于在激素结合中有缺陷的第一种突变体受体与在信号世代中有缺陷的第二种突变体受体的共表达。据报导这两种突变体的共表达挽救了激素-活化的cAMP产生(Lee等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)277卷，18期，2002；Osuga等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)272卷，40期，1997)。然而，尽管公认GPCR作为潜在药物靶物是极为重要的，但是不存在令人满意的筛选试验，而令人满意的筛选试验要求采集有关可能天然存在的GPCR寡聚体，特别是GPCR杂-寡聚体的功能特性，例如配体结合特性的可靠数据。
技术实现思路
本专利技术人令人意外地发现，在配体结合后，GPCR具有活化与第二种GPCR结合的G-蛋白的能力，在此情况中，两种GPCR均形成寡聚体。具体地且如下文给出的实施例中解释的，本专利技术人已经发现，在细胞中共表达(A)GPCR相对于G-蛋白而言被赋予非功能性的GPCR和G-蛋白的融合蛋白和(B)G-蛋白被赋予非功能性，即不能对GPCR所接受的信号起作用的GPCR和G-蛋白的融合蛋白，产生了下列复合物A、B、AA、BB、AB和BA，其中仅AB和BA为功能性的，即G-蛋白被活化以结合GTP并启动GPCR信号级联放大。基本策略利用如下事实可以将GPCR/G-蛋白α亚单位融合蛋白(Milligan，2000；Milligan，2002)看作含有GPCR和G-蛋白这两种成分的序列和功能特性的双-功能多肽类。通过产生不同的突变体对，其中第一种在GPCR中得到突变而使其不能活化与之融合的野生型G-蛋白，而第二种在G-蛋白中得到突变，使得它不能被与之连接的野生型GPCR活化，本专利技术人证实当共表达这两种突变体时，功能可以得到恢复。因此，只有包括至少每种突变体的寡聚体才能产生功能互补且能够产生对激动剂配体产生反应的信号。本专利技术人理解可以将这种现象用于提供可靠的筛选试验，以便测定GPCR寡聚体，特别是杂-寡聚体的特性并提供这类试验中使用的生物学试剂。因此，本专利技术在其最一般的方面中提供了用于测定GPCR寡聚体的功能特性，包括测定潜在的配体的材料和方法。术语GPCR在本领域中众所周知且指的是任意细胞表面跨膜蛋白，当被合适的化合物活化时，它由此活化鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-蛋白)。本专利技术在第一个方面中提供了包括GPCR寡聚体的生物学试剂，所述的GPCR寡聚体含有(a)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中相对于结合的第一种G-蛋白而言，第一种GPCR为非功能性的；(b)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的。术语“非功能性”指的是与野生型相反，蛋白质(GPCR或G-蛋白)不能执行特定的生物功能。因此，GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的这一事实指的是它相对于G-蛋白而言不能执行其野生型的生物功能，即不能在配体结合后活化G-蛋白。优选野生型的其它生物功能特征(例如配体结合)得到保持。同样，非功能性G-蛋白不能执行其野生型生物功能，即在来自GPCR的刺激后不能启动细胞信号级联放大。第一种和第二种GPCR形成寡聚体的能力使得功能性的第二种GPCR接触功能性的第一种G-蛋白的环境。功能性GPCR随之能够活化功能性G-蛋白，而活化的G-蛋白由此产生细胞信号级联放大。第一种和第二种GPCR可以相同，即均-寡聚体，例如均二聚体、均三聚体或高级寡聚体；或第一种和第二种GPCR可以不同，即杂-寡聚体，例如杂二聚体、杂三聚体或高级寡聚体。理想的情况是，所述的寡聚体存在于细胞膜中。如果第一种和第二种GPCR及其结合的G-蛋白在细胞中得到共表达，那么可以便利地实现这一目的。因此，需要GPCR及其G-蛋白彼此结合为融合蛋白。然而，本领域技术人员理解其它结合方式是可能的。例如，可以通过偶联方式，诸如结合对、化学键等或单纯通过在细胞环境中的自然结合使蛋白质彼此结合。本专利技术还提供了用于生产第一个方面的生物学试剂且特别是用于本专利技术方法的突变体GPCR/天然G-蛋白融合蛋白(即包括修饰的非功能性GPCR/功能性G-蛋白)以及相应的核酸构建体。可以对蛋白质序列进行较少的修饰，例如，可以将附加表位添加到受体的N-末端，导入间隔节段，以便在GPCR蛋白质序列与G-蛋白序列之间产生缺口和/或除去G-蛋白基因的末端甲硫氨酸。本领域技术人员可以预计许多这类修饰，条件是在受体/G-蛋白融合蛋白的使用过程中的功能性基本上保持不受影响。此外，本专利技术提供了如本文所述的突变体GPCR/G-蛋白融合蛋白在本专利技术方法中的应用(即包括修饰的非功能性GPCR/功能性G-蛋白或功能性GPCR/非功能性G蛋白)。本专利技术的核酸构建体包括核酸，一般为编码符合读框的融合的特定受体的DNA、R本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含复合物的生物学试剂，所述的复合物具有：（ａ）与第一种Ｇ－蛋白结合的第一种ＧＰＣＲ，其中相对于结合的第一种Ｇ－蛋白而言，第一种ＧＰＣＲ为非功能性的；（ｂ）与第二种Ｇ－蛋白结合的第二种ＧＰＣＲ，其中第二种Ｇ－蛋白为非功能性的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G米利根，D贝汉，
申请(专利权)人：格拉斯哥大学管理处，
类型：发明
国别省市：GB[英国]