新药物靶点基因CK1α制造技术

公开了ＣＫ１α的拮抗剂在治疗疾病中的用途以及用ＣＫ１α筛选可能的治疗药物的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物药物领域，特别是涉及CK1α的拮抗剂在治疗疾病中的用途以及用CK1α筛选可能的治疗药物的用途。
技术介绍
“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因产物本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因产物能否成为药靶的关键步骤。国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性(conservativity)，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化，蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而抑制因子IκB等则相反，在磷酸化状态时被降解而失去活性，而在非磷酸化状态时具有活性。蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症(inflammation)反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-κB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决定性的作用，以及磷酸激酶在信号转导通路极其重要的地位，设计和开发以磷酸激酶为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。目前针对激酶的药物包括PKC活性调节剂、PKA抑制剂、PTK抑制剂和受体介导的钙通道调节剂等，其中部分已经进入临床试验。但现有的激酶药物靶点尚远远不能满足人类战胜疾病、攻克肿瘤的需求，我们仍需更特异、更有效的新的激酶作为药靶，从而有效拓宽治疗疾病的途径，增进人类的健康。肿瘤坏死因子(TNFα)是一个多功能的细胞因子，主要参与体内炎症反应和免疫功能的调节，也能够调控某些肿瘤细胞的凋亡过程。TNFα与受体结合后，在效应细胞中可以激活不同的细胞内信号通路，包括NF-κB、JNK及细胞调亡途径的活化，从而表现出不同的细胞效应。异常的TNFα产生和持续活化与多种人类疾病有关，如败血症，休克，糖尿病，移植排斥，以及多发性硬化、类风湿关节炎和免疫性肠病等多种自身免疫疾病。在TNFα异常引起的炎症性疾病中，NF-κB通路的活化是一个关键环节。后者是一类细胞转录因子，调节多种炎症相关靶基因的转录。最近的研究也显示，在慢性炎症进展至癌前病变，导致肿瘤发生的过程中，NF-κB起了非常重要的促进作用。因此，在临床治疗当中，开发TNα的阻断剂，或者拮抗TNFα激活NF-κB环节的药物，是未来抑制炎症药物的研究开发方向。对于前者，全球最大生物技术公司Amgen的Enbrel，制药巨头强生公司的Remicade和雅培公司的Humira，这些药物都是TNFα的基因工程可溶性受体，可以阻断与细胞受体的结合；这些药物的年销售额突破了十亿美金，已经成为药物界名副其实的新型“重磅炸弹”药物。针对于阻断TNFα细胞内信号通路的药物开发，已成为下一步药物开发的重点，目前尚无有针对性的药物报道。因此，目前对于寻找TNFα细胞内信号通道的抑制剂及其作用机制有迫切的需要。
技术实现思路
为了这种需求，本专利技术人通过研究，发现CK1α能够对NF-κB通路的活性产生影响，并利用该机制确定了在该通路中与其作用的受体蛋白为RIP(receptorinteracting protein受体结合蛋白)。因此，在本专利技术的一个方面，提供了一种筛选NF-κB通道受体的方法，该方法包括a)使CK1α和可能的受体在细胞中接触；b)测定NK-κB表达的上调。在本专利技术的另一个方面，提供了CK1α蛋白拮抗剂在制备下调NF-κB的药物中的用途。优选该药物用于治疗TNFα异常引起的炎症性疾病。更优选的，炎症性疾病选自败血症、休克、糖尿病、移植排斥、多发性硬化、类风湿性关节炎和免疫性肠病。在该方面的一个实施例中，CK1α蛋白拮抗剂是CK1α蛋白的46位赖氨酸突变为丙氨酸。在该方面的另一个实施例中，CK1α拮抗剂作用与CK1α竞争RIP受体位点。在本专利技术的另一个方面，提供了CK1α蛋白拮抗剂在制备抑制p53基因的药物中的用途。优选CK1α蛋白拮抗剂是CK1α蛋白的46位赖氨酸突变为丙氨酸的突变体。在此，“拮抗剂”指能够抑制CK1α功能的那些物质。如本领域技术人员已知的，包括竞争性抑制蛋白，其可以是突变的无活性蛋白质，与野生型蛋白竞争结合位点；或与CK1α蛋白结合使其失活的化合物；还包括核酸水平上的反义核酸；能够表达CK1α失活蛋白的表达载体等。附图说明图1是应用荧光素酶报告基因系统研究CK1a对NF-κB活性的影响的结果。用加入的各种样品对NF-κB-Luc的表达活性作图。图1A显示了CK1α能增强TNFα对NF-κB报告基因的激活作用，而CK1αM可以抑制该效应。图1B显示了CK1α对NF-κB报告基因有激活作用。图2是实施例2的蛋白质印迹分析结果。图3是实施例3的反向及半内源性免疫共沉淀的结果。图3A是在293T细胞中共表达FLAG-RIP与MYC空载体或MYC-CK1a，用抗MYC免疫沉淀表达蛋白，用抗FLAG检测。图3B是内源性RIP结合于细胞内过表达的FLAG-CK1a。在293T细胞中表达FLAG-CK1a，用FLAG抗体和对照MYC抗体免疫沉淀，用RIP抗体检测。图4A是RIP的结构域组成及其分段克隆策略的示意图。图4B是实施例4的蛋白质印迹分析结果。图5A是实施例5的蛋白质印迹分析结果。图5B是实施例5中的体外磷酸化实验的放射性自显影分析结果。图6是应用荧光素酶报告基因系统研究CK1a对RIP对NF-κB报告基因的激活作用的结果。用加入的各种样品对NF-κB-Luc的表达活性作图。图6A显示在293T细胞中，CK1α能增强RIP对NF-κB报告本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选ＮＦ－κＢ通道受体的方法，其特征在于，该方法包括：ａ）使ＣＫ１α和可能的受体在细胞中接触；ｂ）测定ＮＫ－κＢ表达的上调。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗楹，王勇，
申请(专利权)人：上海睿星基因技术有限公司，北京诺赛基因组研究中心有限公司，中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]