体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法技术

本发明专利技术体液中５’－核苷酸酶的化学发光测定方法，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。它所要解决的是现有检测范围窄、灵敏度低、操作难度大、设备昂贵等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案：体液中５’－核苷酸酶的化学发光测定方法，其特征在于５’－核苷酸酶催化环腺苷一磷酸，生成肌苷和ＰＩ；ＰＩ和肌苷在ＰＮＰ作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经ＨＲＰ催化使化学发光物发光；用已知浓度的５’－核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的５’－核苷酸酶含量可从该曲线推算出来。它灵敏度更高、线性范围宽、安全适用、便于普及，适于大、中、小各类医疗机构广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医用试剂检测方法，特别涉及体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法。
技术介绍
利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高达10-18mol，可在20分钟内快速测定出结果，可简便实现完全自动化，有效期长达一年以上，无放射性和致畸物质，利于环保而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。目前，化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)和免疫化学发光分析(Immunochemiluminometricassay，ICMA)；从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白。5’-核苷酸酶(5’-NT)广泛在于肝脏和各种组织中，血清中此酶升高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄胆、原发及继发性肝癌等，而且通常其活力变化与ALP的变化相平行。但在骨骼系统疾病，通常ALP活力增高而5’-NT正常，故对ALP活力增高的患者，测定5’-NT有助于鉴别ALP活力增高的起因。现在普遍使用的测定体液中5’-核苷酸酶的方法为比色法，该法是利用5’-核苷酸酶催化5’-磷酸腺苷(AMP)水解，产生腺苷和磷酸，用比色法测定无机磷的含量，从而计算血清中的5’-核苷酸酶的浓度。该法的不足之处主要有1、线性范围窄。由于检测对颜色的变化分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。2、灵敏度不如化学发光。酶法是比颜色的深浅，而化学发光是测定光信号，灵敏度要高出许多。3、只能用仪器操作。有的是测定酶促反应的速率，对时间要求十分严格，手工或半自动操作均难达到要求，只能使用全自动设备进行。4、全自动生化仪昂贵。目前使用的全自动生化仪几乎全为进口，设备十分昂贵，大多在几十万到几百万之间，中小医院难以承受，普及使用受到限制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是一种提供能克服上述缺陷、且灵敏度高、线性范围宽、方便、安全的体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法。解决该技术问题采用的主要技术方案体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法，其特征在于5’-核苷酸酶催化环腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的5’-核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的5’-核苷酸酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺。本专利技术与现有技术相比有如下优点用化学发光物代替显色物，达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用该方法可以制备相应的定量测定5’-核苷酸酶的商品试剂盒。具体优点是①灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。②线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达105。③安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。④便于普及。本专利技术所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。⑤巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。具体实施例方式现举例说明本专利技术的实施例。5’-核苷酸酶催化环腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的5’-核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的5’-核苷酸酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺；这便是本专利技术的体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法。本专利技术的反应原理用式子表示如下 一、试剂配制环腺苷缓冲液；混合酶液；5’-核苷酸酶标准(或替代品)单一或系列浓度；底物液。二、测定程序，按下表进行，加样单位为μl。 三、用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其血清5’-核苷酸酶的浓度。或直接由公式求出5’-核苷酸酶浓度＝(样品RLU/标准RLU)×标准浓度四、也可用双试剂测定。本专利技术的灵敏度更高因为传统方法是检测颜色深浅，而本专利技术是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。线性范围宽这是因为传统的测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，本专利技术的化学发光检测范围高达105。安全适用本专利技术的化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。便于普及本专利技术所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。社会效益巨大用本专利技术的化学发光测定方法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。本专利技术方法简单，适于大、中、小医疗机构广泛推广应用。权利要求1.体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法，其特征在于5’-核苷酸酶催化环腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的5’-核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的5’-核苷酸酶含量可从该曲线推算出来。2.根据权利要求1所述的体液中5’-核苷酸酶的化学发光测定方法，其特征在于所述的化学发光物为鲁米诺。全文摘要本专利技术，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。它所要解决的是现有检测范围窄、灵敏度低、操作难度大、设备昂贵等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案，其特征在于5’－核苷酸酶催化环腺苷一磷酸，生成肌苷和PI；PI和肌苷在PNP作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的5’－核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的5’－核苷酸酶含量可从该曲线推算出来。它灵敏度更高、线性范围宽、安全适用、便于普及，适于大、中、小各类医疗机构广泛应用。文档编号C12Q1/28GK1912597SQ20061011499公开日2007年2月14日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日专利技术者王京, 高淑舫 申请人:福建省洪诚生物药业有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
体液中５’－核苷酸酶的化学发光测定方法，其特征在于５’－核苷酸酶催化环腺苷－磷酸，生成肌苷和ＰＩ；ＰＩ和肌苷在ＰＮＰ作用下产生次黄嘌呤；次黄嘌呤经其氧化酶作用生成过氧化氢，经ＨＲＰ催化使化学发光物发光；用已知浓度的５’－核苷酸酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的５’－核苷酸酶含量可从该曲线推算出来。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王京，高淑舫，
申请(专利权)人：福建省洪诚生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]