一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的ＰＣＲ检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组ＤＮＡ，然后经ＰＣＲ反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明专利技术的优点在于：可同时检测食品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法。
技术介绍
目前，国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌，而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此，几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面，FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列，而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例，拟态弧菌、至今仍未见到过。除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已开始关注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前，由于在水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌，因此，有必要研究一种方法，可同时检测多个致病性弧菌。这样，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本，以适应加入WTO后的新的形势需求，与国际方法接轨。
技术实现思路
本专利技术提供了一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其优点在于可同时检测以上三种致病性弧菌，在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。本专利技术所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本专利技术所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，采用霍乱弧菌的胶原酶基因(vcc，AE004243)、拟态弧菌的溶血素基因(vmh，VMU68271)和副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh)为一组检测霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌(三重PCR)，检测出霍乱弧菌后再以vcc、霍乱肠毒素基因(ctx，AF516349)为一组确定霍乱弧菌是否具有霍乱肠毒素基因(V.c二重PCR)。其优点在于可同时检测以上三种致病性弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。附图说明图1为本专利技术的流程图。图2为本专利技术的引物序列表图。图3为本专利技术的V.c、V.m和V.p三重PCR检测结果示意图。图4为本专利技术的V.c.的二重PCR检测结果示意图。图5为本专利技术两份实施例的PCR检测结果图。其中，图3中，1从上到下三个条带依次为副溶血弧菌产生的450bp的条带、拟态弧菌产生的243bp的条带和霍乱弧菌产生的155bp的条带；2霍乱弧菌产生的155bp的条带；3拟态弧菌产生的243bp的条带；4副溶血弧菌产生的450bp的条带；5阴性对照；6Marker(100bp-1000bp)。图4中，1非O1/非O139群霍乱弧菌产生的155bp的条带；2从上到下依次为O1/O139群霍乱弧菌产生的708bp的条带和155bp的条带；3溶藻弧菌没有产生条带；4阴性对照；5Marker(100bp-1000bp)。图5中，1第一份甲鱼蛋，2第二份甲鱼蛋，3第三份甲鱼蛋，4第四份甲鱼蛋，5第一份墨鱼，6第二份墨鱼，7第三份墨鱼，8霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌，9阴性对照，10100bp Marker。具体实施例方式本专利技术所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。所述的PCR反应为先做三重PCR反应，检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应。其中，三重PCR反应反应体系为H2O12.3μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，引物Pn(0.4*6)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，总体积为20μl，所述的V.c二重PCR反应，其反应体系为H2O12.5μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，Pvcc(0.4*2)μl，Pctx(0.7*2)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，总体积为20μl。PCR反应循环参数为94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。以下结合具体实施例子说明实施例一墨鱼的检测1.无菌操作，取25g面包虾样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。6.加样，做PCR7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。8.EB染色20min，漂洗，拍照。9.分析谱图实施例二甲鱼蛋的检测1.无菌操作，取25g文蛤样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。6.加样，做PCR7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。8.EB染色20min，漂洗，拍照。9.分析谱图针对上述两个实施例的谱图分析根据本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的ＰＣＲ检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组ＤＮＡ，然后经ＰＣＲ反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓蓉，郑晶，陈彬，吕海沧，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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