一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明专利技术诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227；采用同源重组缺失技术从S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得了缺少wadC基因、具有良好遗传稳定性的光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1‑ΔwadC。本发明专利技术还提供一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，包含一定浓度配比的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1‑ΔwadC，免疫小鼠实验证明，本发明专利技术RS双价疫苗既具有较好的免疫保护和安全性，又可以实现自然感染抗体与免疫所涉及的脂多糖(LPS)抗体的鉴别诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用
本专利技术涉及布鲁氏菌病保护菌株
，尤其涉及一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌细菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。我国与人类布病有关的传染源主要是患病羊、牛。感染动物可从乳汁、粪便和尿液中排出病原菌，长期或终身带菌，当患病母畜流产时，大量病菌随着流产胎儿、胎衣和子宫分泌物一起排出，成为最危险的传染源。布病疫苗是实施控制动物布病的重要手段。我国现有的动物布病疫苗有：猪、牛、羊均可使用的布鲁氏菌活菌苗(S2株)，主要用于羊的布鲁氏菌活菌苗(M5株)，以及从国外引进用于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)。其中，S2株应用最为广泛，据2011-2013年中国兽医药品监察所生物制品产品批签发的统计数据，我国每年使用S2株疫苗达1.5亿头份以上，占动物布病疫苗的98％以上。国际上，目前在使用的动物布病疫苗有：用于羊的布鲁氏菌活菌苗(Rev.1株)，用于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)及极少数地方在使用的布鲁氏菌活疫苗(RB51株)。根据菌株表型的不同，布鲁氏菌病疫苗可分为光滑(Smooth，S)型疫苗和粗糙(Rough，R)型疫苗。普遍使用的为S型疫苗，但历史上曾经短暂使用过R型灭活疫苗45/20，上世纪90年代，美国批准了另一种R型布鲁氏菌病活疫苗RB51，但至今只有极少数地方使用。S型活疫苗有较好的免疫效果，但免疫抗体会干扰对野毒感染的抗体诊断，并且存在一定的安全性问题；R型活疫苗能区分感染与免疫的涉及LPS抗体的诊断且安全性有所提高，但是其免疫保护弱于S型活疫苗。本专利技术通过用诱变剂诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得粗糙(R)型布鲁氏菌RM227，通过同源重组由S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，两种菌株经优选配比，制备成布鲁氏菌病RS双价疫苗，本专利技术的RS双价疫苗既具有S型布鲁氏菌病活疫苗的良好免疫保护力，又兼具R型布鲁氏菌病活疫苗能区分自然感染抗体与免疫所涉及的脂多糖(LPS)抗体的诊断，还具有与R型布鲁氏菌病活疫苗近似的安全性，为预防布鲁氏菌病提供一种新型疫苗。
技术实现思路
本专利技术公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌株，获得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.19808。所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养基中配制成R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌株，37℃恒温摇床培养3天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁氏菌RM227。所述R型布鲁氏菌诱变培养基的制备方法为：取0.1克诱导剂吖啶黄溶于100mL灭菌蒸馏水中，此为原液；取15gTSB溶于500mL蒸馏水中，121℃15min高压灭菌，待其冷却至室温，加入上述配制原液0.5μL，置于37℃恒温摇床，1天后取出备用，即为诱变培养基。所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组基因获得菌株，获得的菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，于020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.19807。所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为：(1)扩增羊种布鲁氏菌Rev.1的wadC基因上、下游同源臂，获得目的基因片段wadC-U和wadC-D；(2)融合羊种布鲁氏菌的wadC基因上、下游同源臂，获得融合后目的片段wadC-UD；(3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC19-SacB，构建重组质粒pUC19-SacB-wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中，再接种到氨苄平板培养基上，长出菌落后，将菌落原位复制接种到氨苄平板培养基和蔗糖平板培养基上，挑取氨苄板上长出而同时蔗糖板没有长出的菌落为单交换菌；挑取单交换菌菌落同时划线接种到氨苄板，蔗糖板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即为双交换菌；对双交换菌进行PCR鉴定，对确定获得的wadC缺失菌株，命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。本专利技术还公开上述布鲁氏菌保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。本专利技术还公开一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，所述RS双价疫苗的生产菌株包含权利要求2或3所述的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和权利要求4或5所述的光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的配比浓度为106-7:1；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的配比浓度为107:1。所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为1011CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC浓度为104CFU/mL-106CFU/mL；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为1011CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC浓度为104CFU/mL。所述RS双价疫苗中还包括疫苗保护剂；优选地，所述疫苗保护剂为明胶蔗糖疫苗保护剂。所述布鲁氏菌病RS双价疫苗采用冻干工艺制备，所述冻干工艺为已批注的布鲁氏菌病活疫苗常规冻干工艺。本专利技术具有有益效果如下：1、本实验通过诱导剂成功诱导了一株具有良好遗传稳定性的减毒株粗糙(R)型布鲁氏菌RM227,诱导株RM227缺失基因中包含wboA和wboB基因，影响细菌的生长繁殖，较亲本株对小鼠巨噬细胞的增殖能力有着明显的下降。2、本专利技术通过同源重组基因技术获得一株具有良好遗传稳定性的减毒株光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，缺失wadC基因，对细菌的生长繁殖无影响，其在胞内存活率低于亲本株。3、将粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC混合成双价疫苗，用其免疫小鼠，在一定浓度配比范围内，两者间既存在协同作用提高免疫保护，又可区分自然感染抗体与免疫所涉及脂多糖(LPS)抗体的诊断，而且安全性良好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。/n

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。


2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌株，获得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227，保藏编号为CGMCCNO.19808。


3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养基中配制成R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌株，37℃恒温摇床培养3天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁氏菌RM227。


4.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组技术获得菌株，获得的菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，保藏编号为CGMCCNO.19807。


5.根据权利要求4所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为：
(1)扩增羊种布鲁氏菌Rev.1的wadC基因上、下游同源臂，获得目的基因片段wadC-U和wadC-D；
(2)融合羊种布鲁氏菌的wadC基因上、下游同源臂，获得融合后目的片段wadC-UD；
(3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC19-SacB，构建重组质粒pUC19-SacB-wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1感受态细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，徐磊，孙浩杰，毛开荣，辛凌翔，丁家波，蒋卉，任小侠，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11