一种牛源蜡样芽孢杆菌及其应用制造技术

一种牛源蜡样芽孢杆菌M001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株分离自猝死病牛的血液；菌落为中央呈红色四周呈灰白色且周边不整齐的蜡滴样菌落。镜下检查可见，该菌两端平齐，大小约为1.0×6.0um，多以长链排列，为格兰氏阳性菌。特殊染色后将其置于显微镜下观察，未观察到伴孢晶体；16SrDNA序列如序列表；该菌株对克林霉素、庆大霉素类药物敏感，对红霉素、米诺环素等药物中度敏感，对头孢他啶、氨曲南等药物耐药；该菌对牛具有致病性及致死性。可用于牛疫病检疫对照样品或用作为牛疫病预防疫苗的菌种。

【技术实现步骤摘要】
一种牛源蜡样芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种家畜微生物及用途，即一种可致死性牛源蜡样芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus.Frankland）属芽孢杆菌科，蜡样芽孢杆菌属，该菌与苏云金芽孢杆菌及炭疽杆菌等生物学特性相近，广泛存在于自然环境及食物中。可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境。部分蜡样芽孢杆菌可作为促植物生长剂及动物饲料内的微生物添加剂。该细菌为条件致病菌，临床多使人或动物发生呕吐或腹泻，为常见的食源性致病菌之一。但在此之前并未查到该细菌对牛感染致死的相关报道。2018年内蒙古通辽市多地出现牛猝死病例，我们对其中的两头病死牛进行炭疽杆菌病、口蹄疫病毒病等传染性疾病的排查后，对其血液进行细菌培养并发现有菌落生长。对生长细菌进行分离鉴定，最后确定其为蜡样芽孢杆菌。深入研究蜡样芽孢杆菌的致病性及防治措施，对于发展养牛业，降低疫病损失，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛源蜡样芽孢杆菌及其应用。上述目的是由以下技术方案实现的：一种牛源蜡样芽孢杆菌，其特征在于：牛源蜡样芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年04月25日，保藏号为CGMCCNo.17626，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus。所述菌株信息如下：1.来源：该菌株分离自猝死病牛的血液;2.形态学特征：菌落为中央呈红色四周呈灰白色且周边不整齐的蜡滴样菌落。镜下检查可见，该菌两端平齐，大小约为1.0×6.0um，多以长链排列，为革兰氏阳性菌。特殊染色后将其置于显微镜下观察，未观察到伴孢晶体。生理生化特征：1)16SrDNA序列如序列表;2)抗生素敏感性：该菌株对克林霉素、庆大霉素类药物敏感，对红霉素、米诺环素等药物中度敏感，对头孢他啶、氨曲南等药物耐药;3)致病性：通过动物实验证明该菌对鼠具有致病性及致死性。所述的蜡样芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌用于牛疫病检疫对照样品。所述的蜡样芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌用作牛疫病预防疫苗的菌种。本专利技术的有益效果是：找到牛猝死疫病的致病细菌，为防治牛猝死病提供了可参照的样品、参数及防疫用品，可大幅缩短疫病的确诊时间，降低牛的疫病损失，为发展养牛业提供保障。附图说明图1是菌落镜下形态图；图2是电泳分析条带图；图3为进化树图谱。具体实施方式贰零壹捌年内蒙古通辽市多地出现牛猝死病例，我们对其中的两头病死牛进行炭疽杆菌病、口蹄疫病毒病等传染性疾病的排查后，对其血液进行细菌培养并发现有菌落生长。对生长细菌进行分离鉴定，最后确定其为蜡样芽孢杆菌。在此之前并未查找到该细菌感染牛致死的相关报道，因此对其进行生物学鉴定。该菌株最初在普通琼脂培养基中，37℃条件下经48h培养出现中央呈红色四周呈灰白色且周边不整齐的蜡滴样菌落。镜下检查可见，该菌两端平齐，大小约为1.0×6.0um，多以长链排列，为革兰氏阳性菌（图1）。特殊染色后将其置于显微镜下观察，未观察到伴孢晶体。对该细菌进行16srDNA序列分析：菌株接种于LB液体培养基中，37℃，200r/min，培养12h。取1mL菌液经离心进行具体收集，之后进行DNA提取。设计细菌16SrRNA通用引物(F:5/-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3/,R:5/-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3/)进行PCR实验。PCR条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。之后进行电泳分析，得出1500bp左右条带（图2）。将目的条带进行胶回收，之后送至生物公司进行测序，获得其核酸序列。（见序列表）。将所获序列在核酸数据库NCBI中进行检索，匹配结果显示，该菌为蜡样芽孢杆菌。对其进行进化树分析，结果如图3。1.参考文献设计蜡样芽孢杆菌毒素基因及其看家基因引物进行PCR实验（见表1），结果显示该菌含有肠毒素基因（hblA、hbC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT、entFM）、细胞毒素基因（cytK）及看家基因（ropB、gyrB、groEL）。表1毒素引物及退火温度2.生化实验：结果显示，该菌的生化特性符合蜡样芽孢杆菌属（见表2）。表2生化实验项目结果精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+L-焦谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素—甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+3-甲基戊二酸+D-果糖+黏菌素+D-葡萄糖酸+D-甘露糖+亚氨基二乙酸+α-酮戊二酸+3-甲基己二酸+多粘菌素B+胸腺嘧啶脱氧核苷+4甲基伞型酮-AD-葡萄糖苷酸—4甲基伞型酮-BD-纤维素二糖甙+4甲基伞型酮--BD-半乳糖苷—4甲基伞型酮-BD-葡萄糖苷酸—4甲基伞型酮-BD-葡萄糖苷+4甲基伞型酮-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷—4甲基伞型酮-磷酸+4甲基伞型酮-磷酸（带海藻糖）+丙氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺—L-脯氨酸-对硝基苯胺+缬氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺—对硝基苯-AD-葡萄糖苷+对硝基苯-磷酸+β-龙胆二糖—右旋糖+D-蔗糖+D-塔格糖—D-海藻糖+麦芽糖+麦芽三糖+N-乙酰-葡萄糖胺+尿素—七叶苷+麦芽三糖—N-乙酰-葡萄糖胺—α-甲基葡萄糖苷—3.药敏实验：选择多种药物对其进行药敏试验，结果显示结果显示该菌对克林霉素、庆大霉素类药物敏感，对红霉素、米诺环素等药物中度敏感，对头孢他啶、氨曲南等药物耐药（见表3）。表3药敏实验药物名称抑菌环直径（mm）克林霉素35庆大霉素32红霉素13米诺环素14头孢他啶0氨曲南04.致病性实验：为检测该菌的致病性进行动物实验。取生长良好的昆明小鼠9只分3组，每只注射0.6mL菌液，3组菌液浓度分别为104CFU/mL，106CFU/mL，108CFU/mL。108CFU/mL组注射6h后小鼠全部死亡，106CFU/mL组注射12h后全部死亡，104CFU/mL组注射6h后小鼠精神萎靡，全身颤抖。对死亡小鼠进行剖检在其实质性脏器内重新分离到该菌，即该菌具有致病性及致死性。5.应用简介（1）为牛疫病防治提供理论依据。此研究表明蜡样芽孢杆菌对牛具有致死性。在此之前蜡样芽孢杆菌一直被认为是条件性致病菌，对人或动物带来轻微的危害。此次致死性的发现，提醒我们要加强对蜡样芽孢杆菌的研究，做好整体生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛源蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述牛源蜡样芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期 2019 年 04 月 25 日，保藏号为CGMCCNo.17626，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛源蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述牛源蜡样芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年04月25日，保藏号为CGMCCNo.17626，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。


2.根据权利要求1所述牛源蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株信息如下：
（1）来源：该菌株分离自猝死病牛的血液；
（2）形态学特征：菌落为中央呈红色四周呈灰白色且周边不整齐的蜡滴样菌落，镜下检查可见，该菌两端平齐，大小约为1.0×6.0um，多以长链排列，为格兰氏阳性菌，特殊...

【专利技术属性】
技术研发人员：马德慧，王学理，宋丽丽，张玲艳，贾伟娟，
申请(专利权)人：内蒙古民族大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15