定量检测小颗粒低密度脂蛋白的方法技术

本发明专利技术的目的是提供用于小颗粒ＬＤＬ的分级检测的快速而简单的方法。定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，该方法包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三脂或者蛋白质。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分级，其对于动脉硬化的临床诊断是重要的。
技术介绍
低密度脂蛋白(LDS)在血液中胆固醇运输中起重要作用并且是动脉硬化的危险因素。公知小颗粒低密度脂蛋白(下文中“小颗粒LDL”)在LDL中颗粒尤其小并且比标准LDL密度更高，并且与正常LDL相比，使动脉硬化的危险性增加数倍。小颗粒LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一。分级检测小颗粒LDL在临床上非常重要。检测小颗粒LDL的常规方法使用超速离心、电泳、高速液相层析，等等。超速离心方法通过使用密度的不同分离小颗粒LDL，并检测其中的胆固醇和蛋白质的量。小颗粒LDL在1.040到1.063之间的密度被分级分离(Atherosclerosis，48，33-49页，1993Atherosclerosis，106，241-253页，1994，等)。然而，该方法需要昂贵的设施，并且检测很耗时。电泳方法使用聚丙烯酰胺凝胶检测LDL的运动性和颗粒直径。小颗粒LDL的颗粒大小低于25.5nm(JAMA，260，1917-21页，1988，等)，并且LDL的相对运动性(从VLDL到LDL的移动距离除以从VLDL到HDL的移动距离)不小于0.4(Domyakukoka(alteriosclerosis)，25，67-70页，1997)。然而，这些方法用于检测LDL中小LDL颗粒的程度，并且它们不用于得到定量检测。而且，一次可以试验的样品数受到限制，并且进行检测耗费很长时间。最近，专利技术了检测脂蛋白的方法。在该方法中，电泳后，对琼脂糖凝胶进行脂质染色，并使用计算机分析染色图案，并得到脂蛋白的定量检测(日本专利公开号2000-356641)。这是用于分析变性LDL，如经氧化的LDL、乙酰化LDL、糖基化LDL、MDA-LDL等的方法。通过该方法不能准确检测小颗粒LDL。因为该分析需要非常昂贵的设备，该方法不适于一般用途。通常，在HDL的检测中，公知聚阴离子与二价阳离子的组合可用作分离试剂用以通过凝聚不同于HDL的脂蛋白而分离HDL。例如，使用硫酸葡聚糖-Mg2+(Clin.Chem.28，1379-88页，1982，等)、肝素-Mn2+(J Lipid Res.19.65-76页，1978，等)、肝素-Ca2+(Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975，等)和磷钨酸-Mg2+(Clin.Chem，23，882-84页，1977，等)的方法等是公知的。此外，已经报导了使用一些分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀计算LDL和VLDL的级分的方法(日本专利公开号7-294532，Rinsho-Byori，特别版21，82，1975，等等)。此外，还报导了使用聚乙二醇分离HDL的方法(Ann.Clin.Biochem.18，177-8l页，1981)。此外，还有常规方法，如使用多种分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀，基于浊度的不同检测每种脂蛋白的方法(Rinsho-Byori，特别版2l，82，1975，等等)，和根据不同的离子强度悬浮或者溶解小颗粒LDL并通过吸光度的不同检测小颗粒LDL的方法(日本专利公开号2003-28882)。然而，因为检测光吸光度，所以特异性和准确度不足。专利文件1日本专利公开号2000-356641专利文件2日本专利公开号7-294532专利文件3日本专利公开号2003-28882非专利文件1 Atherosclerosis，48，33-49页，1993非专利文件2 Atherosclerosis，106，241-253页，1994非专利文件3 JAMA，260，1917-21页，1988非专利文件4 Domyakukoka，25，67-70页，1997非专利文件5 Clin.Chem.28，1379-88页，1982非专利文件6 J Lipid Res.19.65-76页，1978非专利文件7 Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975非专利文件8 Clin.Chem，23，882-84页，1977非专利文件9 Rinsho-Byori，特别版21，82，1975非专利文件10 Ann.Clin.Biochem.18，177-81页，1981 专利技术公开本专利技术的目的是提供分级检测小颗粒LDL的快速而简单的方法。如上所述，已经报导了在脂蛋白混合物中使用分离试剂如聚阴离子、二价阳离子等凝聚不同于HDL的脂蛋白。脂蛋白混合物中主要级分如VLDL、LDL和HDL由于它们的物理性质的不同可以通过分离试剂分离。然而，还没有尝试通过更简单的方法将LDL分离成亚级分。本专利技术人已经广泛研究了分离小颗粒LDL的方法，发现通过用适宜浓度的聚阴离子和二价阳离子的处理试样可以将小颗粒LDL与其他LDL分离。还通过加入作为离子强度调节剂的一价阳离子实现小颗粒LDL的更好的分离。此外，通过使用PEG代替聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子得到类似效果。本专利技术人已经详细研究了聚阴离子、二价阳离子和一价阳离子联合使用时这些离子的浓度，还研究了使用PEG时PEG的浓度。通过建立所要使用的一系列浓度，他们发现这样的条件，在该条件下通过凝聚不同于小颗粒LDL的LDL将小颗粒LDL与LDL颗粒分离。通过该反应，不同于小颗粒LDL的LDL形成凝结块，其将通过离心或者过滤从反应混合物除去。凝胶块除去后，通过将检测LDL胆固醇的试剂、检测LDL中甘油三酯的试剂，或者抗人脱辅基蛋白质B抗体，可以定量检测小颗粒LDL中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质，从而完成了本专利技术。与利用离子强度的不同悬浮或者溶解小颗粒LDL后基于吸光度的不同检测小颗粒LDL的上述方法(日本专利公开号2003-28882)相比，本专利技术在特异性和准确度都更优，因为在分离后检测小颗粒LDL中胆固醇、甘油三酯和蛋白质。本专利技术提供了下面的方法和试剂盒(1)定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，其包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质。(2)根据(1)的方法，其中在第一步中用聚阴离子和二价阳离子将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。(3)根据(1)或者(2)的方法，其中在第一步中还用一价阳离子将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。(4)根据(2)或者(3)的方法，其中用于第一步的聚阴离子选自肝素、磷钨酸和硫酸葡聚糖。(5)根据(2)到(4)任一项的方法，其中用于第一步的二价阳离子选自Mn2+、Mg2+和Ca2+。(6)根据(3)或者(5)的方法，其中用于第一步的一价阳离子选自Na+、K+和Li+。(7)根据(4)到(6)任一项的方法，其中当将聚阴离子加入试样中时，该聚阴离子的终浓度对于肝素为10-250U/mL，对于硫酸葡聚糖为0.02-1.25％，对于磷钨酸为0.02-1.25％。(8)根据(5)到(7)任一项的方法，其中当将二价阳离子加入试样中时，该二价阳离子的终浓度对于Mn2+为2.5-35mmol/L，对于Mg2+为2.5-125mmol/L，对于Ca2+为1-75mmol/L。(9)根据(6)到(8)任一项的方法，其中当将一价阳离子加入试样中时，该一价阳离子的终浓度为0-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
定量试样中小颗粒低密度脂蛋白的方法，该方法包括第一步将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离，和第二步检测所分离的小颗粒低密度脂蛋白中胆固醇、甘油三酯或者蛋白质，其中在所述第一步中用ＰＥＧ将小颗粒低密度脂蛋白与其他低密度脂蛋白分离。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤康树，平野勉，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]