肝病的诊断方法和用于筛选治疗这种疾病的分子的方法技术

本申请的目的是肝脏病的诊断方法，该方法包括测定载脂蛋白Ａ４在肝细胞或肝组织中，或者在循环系统（血液、血浆、血清）中的表达。本发明专利技术还涉及筛选用于治疗此类疾病的化合物的方法，即使所述化合物与哺乳动物接触，测量载脂蛋白Ａ４在所述哺乳动物的所述肝源细胞或循环系统中的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请的目的是肝病的诊断方法。其另一个目的是筛选用于治疗这 种疾病的分子的方法。载脂蛋白A4 (Apo A4)是一种大量流通的载脂蛋白。这种蛋白质 的表达在啮齿目动物的下丘脑、小肠和肝脏中一皮证实。在小鼠血浆中存 在的ApoA4的大部分被认为是肠源的(Wu等人，JBC254, 7316-7322 1979)。在人类中，Elshourbagy ( JBC 262 1987)名又述Apo A4的合成一皮限 制在小肠中。Apo A4具有多种功能。它借助于不同的机理调节脂类的运输和代 谢，比如活化自肝组织流出的胆固醇和刺激脂蛋白脂肪酶的活性(Stan 等人，Biochim Biophys Acta, 1631 2003, 177-187)。Apo A4还已知是饱胀感因子。肝病成为公众健康的重大问题。因此借助于特定的敏感测定方法在 尽可能早的时期诊断各种肝病是非常必要的。本申请人意外地发现，Apo A4在人的肝脏中被表达，在肝病时编 码Apo A4的基因的肝脏表达水平明显地增高。本专利技术的目的是肝病的检测、诊断或预测的方法，该方法包括测量 在肝细胞或肝组织中，或者在这些细胞和组织的提取物中，或者在血液 及其衍生物中Apo A4的表达。本专利技术的另一个目的是不仅测量在该细胞或肝组织中Apo A4的表 达，而且还测量在存在肝源Apo A4的血液中的表达。一种方法可包括如下的步骤-分离肝细j包、肝组织或者这些细i包和组织的提取物，或者血液或 其书f生物，以及一测量Apo A4的表达。通过溶解肝细胞和肝组织就能够得到这种提取物。肝病应该理解为 对肝组织和肝细胞具有影响的各种疾病，可以是慢性的，也可以是病原 性的(酒精性、病毒性、毒性、饮食性、环境性等)。更具体说，本专利技术的目的是对脂肪肝、肝癌发生、肝硬化、病毒性肝炎、肝细胞功能不足、胆汁郁积、门静脉高血压、脂肪变性和脂肪肝、 肝脏静脉和动脉疾病、纤维化、月巴胖症和代j射综合症的才全测、诊断或预 测的方法。血液书f生物应当理解为通过物理处理(比如离心)或生物处理(例 如，凝结)或化学或其它能够得到这些衍生物的处理方法得到的来源于 血液的各种细胞或非细胞部分。这样的衍生物优选是血浆和血清。按照本专利技术的一个实施方式，所述方法包括测量从在希望诊断或预测肝病的个体的肝细胞或肝组织中编码Apo A4的基因转录的信使RNA (mRNA)的量。将所述哺乳动物.的肝细力包或肝组织，或者在其血液或其衍生物中的 细胞提取，并且用本领域技术人员已知的方法进行处理，特别是为了避 免信使RNA和蛋白质降解，然后测量由编码ApoA4的基因转录的信使 RNA的量。按照特别有利的方式，按照所谓定量聚合酶链式反应即QPCR方法， 通过扩增来测量转录的信使RNA的量。按照这种技术，提取全部RNA并将其提纯，借助于反向转录酶， 将在提取液中所含的信使RNA在第一时间;波转化为互补DNAs (cDNAs)。在本专利技术中优选使用的聚合酶是Taq聚合酶，但也可以是具有聚合 酶活性并可在PCR操作条件下可以使用的各种其它酶。由于其性能，这 种酶可4吏在每一个合成周期中初始的DNA的量倍增。对由生物试样中所含的mRNA衍生得到的cDNA的分析是通过定 量PCR实时进行的。按照基本上包括周期重复的方法，借助于ApoA4 序列的特定引物和探针对cDNA进行扩增，该周期包括如下步骤-通过对由试样制备的cDNA进行加热来分离待扩增的链，-对探针和一对正义引物和反义引物进行杂交，以及-通过用聚合酶延长来进行DNA链的新的合成。正义引物和反义引物有利地含有至少15个核苷酸，并与相应于SEQ ID N。13 (基因数据库No.NM000482)的人的Apo A4序列或与其互补序 列具有至少80%,优选90%,和更优选95%的同一性。在扩增反应过程中，反应产物或amplimdre借助于探针进行^^佥测，该探针由寡核香酸组成，该寡核苷酸包括至少15个核苷酸和与相应于SEQ ID N。13 (基因数据库No.NM000482)人Apo A4的序列或与其互 补序列具有至少80%的同一性，优选90%,更优选95% 。对于正义片段和反义片段分别选择两种引物，使得能够进行DNA 片段的扩增。探针本身的目标是为了与通过两种引物的位置界定的扩增 产生的DNA片段进行杂交。该探针有利地具有比引物的理论Tm高大约10°C ±0.5的理论融合 温度Tm。所述寡核苷酸(引物和探针)优选含有15 ~ 25个核苷酸。该 方法实施多个周期，足可以得到能够测量数量的扩增产物(n=40)。用于编码人Apo A4的基因扩增的引物优选具有如下序列SEQ ID N01: gcagctggctccctatgct以及SEQ ID N。2: ggaaggtcaggccctcaag 。探针优选具有SEQ ID N° 3的序列cacgcaggagaagctcaaccacca,。按照本专利技术的一个优选实施模式，该探针含有显示的分子或者分子 系统。所述显示系统优选由报道基因着色剂和焚光淬灭着色剂构成，它 们分别固定在探针的5，和3'末端上。按照一个有利的实施方式，可显示 系统由分别固定在探针的5，和3，末端上的6-羧基荧光素(FAM)和6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)表示的"报道基因/淬灭基团，，对构成。为了在本专利技术的范围内实施PCR,可以参考PCR技术的一般性综 述，试剂和热循环器制造商和销售商的i兌明书，特别是由Perkin Elmer Applied Biosystem出片反的才示题为《Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection》的说明书(1999 )和PCR操作规程(Academic Press出版社New-York 1989 )。4吏用QPCR才企测法的优点之一就是对PCR产物的分析可通过读出 在该周期的过程中得到的荧光而直接在PCR周期的末尾进行。因此，不 必使用PCR产物，对于后面的分析，这种产物是具有被污染的风险的。另外，对在反应开始时使用的靶的数目进行定量是很可靠的并且是 可重现的。借助于荧光探针在PCR周期的过程中进行PCR产物的检测。 这对于检测PCR的产物这是必要的，且该检测刚好在PCR指数期而不 是在最终点进行。因此，此检测原理是更为灵敏而具有特异性的。QPCR的另一个优点在于，由于"热启动"的原理，避免了非特异性的扩增，PCR是在初期变性时活化的热稳定的DNA聚合酶存在下实 时进4亍的。按照本专利技术的另 一 个实施模式，按照本专利技术的方法包括测量在肝细 胞或肝组织中，或者在血液或其衍生物中存在的Apo A4蛋白质或蛋白 质片段的量。按照一种特别有利的方式，借助于至少一种此蛋白质的特异性抗 体，进行Apo A4蛋白质或蛋白质片段数量的测定。此抗体可通过一种方法得到，该方法在于任选在比如Freund助剂的 助剂存在下，向比如啮齿目的动物注射提纯的人的Apo A4蛋白质乳液 或者大约20个氨基酸的ApoA4肽序列。注射重复进行，收集抗血清。对于希望对肝的Apo A4进行定量的个体，测量在此类抗体与在其 肝细月包或肝组织中或者在血液及其书f生物中存在的Apo A4之间的联 系，可通过各种适当的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝脏病的诊断或预测的方法，该方法包括测定Ａｐｏ　　Ａ４在肝细胞或肝组织中或者在血液及其衍生物中的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P卡塞拉斯，H维达尔，I布伊森，J马钱德，D西蒙，S加利古，
申请(专利权)人：赛诺菲安万特，
类型：发明
国别省市：FR[法国]