一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括包被有抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的平台载体、不同浓度氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品、氧化低密度脂蛋白质控品、生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样本缓冲液、底物A、底物B、终止液、浓缩洗液。本发明专利技术由于所用的检测仪器较为简单，均为通常所用仪器，故检测成本较低，利于推广；并且该试剂盒容易操作，不需要专业的人员即可实现；同时试剂盒内独特的标准品稀释液和样本缓冲液配方，大大提高了检测结果的可靠性和准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外免疫检测
，具体涉及一种检测样本中氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)浓度的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
脂蛋白是血浆胆固醇和甘油三酯的主要载体；低密度脂蛋白（LDL)是一种密度较 低（1. 019~I. 063g/cm3)的血衆脂蛋白，由磷脂，载脂蛋白（ApO)B多肽链，胆固醇，甘油 三酯，碳水化合物等组成，约含25%蛋白质与49%胆固醇及胆固醇酯；氧化低密度脂蛋白 (OxLDL)是天然的低密度脂蛋白（LDL)经氧化修饰形成的脂蛋白。 近年来人们发现OxLDL与动脉粥样硬化有密切的关系。Ox-LDL促使泡沫细胞的 形成，而泡沫细胞的死亡将导致脂类在动脉壁的沉积，这是导致动脉粥样硬化的主要病因 之一。最近研宄表明，在动脉粥样硬化病灶中发现了 OxLDL沉积，在正常动脉壁中没有，此 属于动脉粥样硬化病灶的特有成分，因此，患者体内的OxLDL量远高于正常人，其浓度与病 变范围呈比例。临床认为健康人体内Ox-LDL的含量为200-500 μ g/L，而当临床检测OxLDL 含量大于600 μ g/L时为异常。因此Ox-LDL的检测对动脉粥样硬化心血管病的预警及早期 辅助诊断具有重要意义。 目前，在市面上检测OxLDL浓度常用的试剂种类少，检测成本高，操作繁琐，对实 验操作人员的技能要求高，不利于该项目检测的大范围推广。
技术实现思路
针对上述技术的不足之处，本专利技术提供一种操作简便、便于实验人员掌握、涉及实 验仪器单一、普及率高、检测成本低、检测结果准确，非常利于大范围推广的氧化低密度脂 蛋白（OxLDL)定量检测试剂盒。 一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒，包括包被有抗氧化低密度脂蛋 白克隆抗体的平台载体、不同浓度氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品、氧化低密度脂蛋白 质控品、生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样本缓 冲液、底物A、底物B、终止液、浓缩洗液。 进一步的，所述平台载体为微孔板，所述微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板；所述抗 氧化低密度脂蛋白克隆抗体为抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体；所述氧化低密度脂蛋白克 隆抗体为氧化低密度脂蛋白单克隆抗体；所述底物A为过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液；所述 底物B为四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗液为含有 表面活性剂的磷酸盐缓冲液。 进一步的，所述试剂盒微孔板上抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的数量为 1-50 μ g/孔；氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品为6支、各2ml ;所述氧化低密度脂蛋白质 控品为2支各2ml ;生物素标记的氧化低密度脂蛋白单克隆抗体IOmlU支；辣根过氧化物 酶标记的亲和素 l〇ml、l支；样本缓冲液10ml、l支；过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液10ml、l支； 四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液IOmlU支；硫酸溶液IOmlU支；含有表面活性剂的磷酸 盐缓冲液l〇ml、l支。 进一步的，所述氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品和质控品都是用氧化低密度脂 蛋白纯品与标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述标准品不少于2个，所述质 控品和所述标准品的区别只是浓度不同，所述质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核 准校对的作用，即通过质控品测值是否在质控范围内来对标准品拟合出来的曲线进行核准 校对，若质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的氧化低密度脂蛋白浓度 值。 进一步的，所述的标准品稀释液，是在pH 7. 0-8. 0、浓度为IO-IOOmM磷酸盐缓冲 液中，分别加入1-10%质量分数的动物血清、〇. 01-0. 5%质量分数的防腐剂、1-10%质量分 数的蛋白保护剂、〇. 05-1%质量分数的表面活性剂混合而成。 进一步的，所述样本缓冲液是在PH6. 0-7. 0、浓度为IO-IOOmM的磷酸盐缓冲液中， 分别加入0. l_3mM的金属离子络合剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.01-1 %质量分数 的表面活性剂、0. 01-0. 5%质量分数的防腐剂混合而成；所述底物A是将过氧化氢纯品加 入到浓度为50-100mM柠檬酸盐缓冲液中配制而成；所述底物B是将四甲基联苯胺加入到浓 度为50-100mM柠檬酸盐缓冲液中配制而成；所述浓缩洗液是把质量分数为0. 05-1 %的表 面活性剂加到pH6. 0-7. 0、浓度为IO-IOOmM磷酸盐缓冲液中配制而成。 进一步的，所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20 (Tween 20)、布里 杰-35 (BRIJ-35)、吐温40、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇2000 ;所述的防腐剂为PrOclin 300。 进一步的，所述的金属离子络合剂为乙二胺四乙酸二钠（EDTA_2Na)和乙二胺四 乙酸（EDTA)。 进一步的，所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、甘油、蔗糖。 制备如上所述的试剂盒的方法，包括以下步骤，所述步骤不分前后顺序： 包被有抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的平台载体的制备：将浓度为6-10mg/ml 的特异性抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体用浓度为20-50mmol的磷酸盐缓冲液稀释到浓 度为l-3mg/ml，加入到平台载体上，4-8°C过夜进行包被；然后用浓缩洗液将平台载体清洗 至少3次；再向平台载体上加入含蛋白保护剂的封闭液（所述封闭液包括蛋白保护剂质量 分数8-12%、蛋白质量分数1-3%、防腐剂质量分数0. 1-3%、10-50mM磷酸盐缓冲剂）进行 封闭；等待平台载体至干燥后，真空袋封装，4-8°C存放； 氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品和质控品的制备：是用氧化低密度脂蛋白纯 品与标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释，最后配制成标示浓度为0-1000ng/ml的一 浓度梯度标准品以及80-500ng/ml的质控品；其中标准品稀释液是在pH 7. 0-8. 0、浓度为 IO-IOOmM磷酸盐缓冲液中，分别加入1% -4%质量分数的动物血清、0. 1-0. 5%质量分数的 防腐剂、3-5%质量分数的蛋白保护剂、0. 1-0. 5%质量分数的表面活性剂；所得到的浓度梯 度标准品的浓度分别为〇、50、100、250、500、1000ng/ml，将得到的浓度梯度标准品与质控品 每瓶500ul分装，然后冻干成粉末状，4-8°C保存； 生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体制备：在偶联前将生物素活化；然后将 浓度为l-5mg/ml待标记的氧化低密度脂蛋白抗体用50-100mM碳酸盐缓冲液稀释到浓度 为l-2mg/ml，并用稀释后的碳酸盐缓冲液透析6-15h后；将活化后的生物素溶解于二甲基 亚砜纯品中待用，把处理后的氧化低密度脂蛋白抗体溶解到于碳酸盐缓冲液中，按体积比 1:6-1:10混合含有生物素活化的二甲基亚砜和含有氧化低密度脂蛋白抗体的碳酸盐缓冲 液，在室温下温育4h后用PBS透析纯化；将所得生物素标记氧化低密度克隆抗体加入NaN3或者甘油等体积混合，-15 20°C保存备用； 辣根过氧化物酶标记的亲和素的制备：称取过碘酸钠加入到纯净水中配置得到终 浓度为l〇_15mg/ml的过碘酸钠溶液；将终浓度为10-15mg/ml的过碘酸钠溶液与浓度为 l-2mg/ul的辣根过氧化物酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒，其特征在于：包括包被有抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的平台载体、不同浓度氧化低密度脂蛋白浓度梯度标准品、氧化低密度脂蛋白质控品、生物素标记的氧化低密度脂蛋白克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样本缓冲液、底物A、底物B、终止液、浓缩洗液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐民，张立峰，李晓燕，马志军，吴建榕，马奕晶，
申请(专利权)人：北京协和洛克生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11