用于在原代免疫细胞中表征糖皮质激素受体配体的反式激活和反式阻抑活性的方法技术

本发明专利技术涉及用于通过原代免疫细胞中的基因和／或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体（ＧＲ）配体的反式激活和反式阻抑活性的方法及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在原代免疫细胞中表征糖皮质激素受体配体的反式激活和反式阻抑活性的方法
本专利技术涉及用于通过原代免疫细胞中的基因和/或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体(GR)配体的反式激活和反式阻抑活性的方法。在临床实践中最常用的药物包括糖皮质激素。它们对炎症和免疫系统 以及对代谢具有重要作用。各种作用通过经糖皮质激素受体(GR)的不同机 制介导。选择性糖皮质激素受体(GR)配体代表新一类GR配体，其选择性 地激动或拮抗地影响基因调节的GR机制、基因的反式激活和反式阻抑。 GR配体的反式激活活性与反式阻抑活性的分离或者GR配体的激动作用 与拮抗作用的分离是可能的。在这方面，GR配体的治疗谱将会选择性地 受到影响。为了就反式激活和反式阻抑活性而言体外表征GR配体，目前使用人 和动物细胞系，在某些情况下它们是经启动子构建体转染的。在这些细胞 系中研究GR作用的选择的个别方面。此外，为了检测GR配体的相应活 性，常常需要刺激细胞。从细胞系中的这些测定的结果得出关于原代细胞 中GR配体的作用以及特别是关于人系统的结论的可能性只是非常有限 的。一方面，为了就分子机制而言在体内表征GR配体，使用功能测试。 这方面的实例是当炎症被触发时施用GR配体或者在唤醒代谢性应激时或 在施用代谢调节激素之后检测GR配体的作用。在人体研究中，这种方法 与较多问题相关或者是不可行的。另一方面，在试验条件下，在提取的靶 器官或器官样品中直接检测GR配体介导的基因调节。这种方法对于人体 研究一般是不可能的。基于现有测定法的以上提及的、明显的局限，期望开发下述测定法， 其l)对于表征原代细胞中的GR配体作用具有更大的相关性和2)可以被用 于在人体研究中表征GR配体的分子机制而不产生明显应激。想法是确定原代免疫细胞中的反映GR配体在它们的调节中的反式激 活和反式阻抑活性的基因。为此，在用选择性GR配体的筛选中选择基因，所述选择性GR配体 在未受刺激的人外周血原代免疫细胞中具有确定的反式激活和反式阻抑 活性，所述基因以快速、可重复和一致的方式反映该物质在抑制或诱导基 因表达方面的反式激活或反式阻抑活性。在剂量/作用和动力学研究中进一 步表征所述选择性GR配体对所选基因的调节。动物模型中的动力学研究 证实在体内条件下基因调节的重复性。已经证实IL-1(3、 IL-8、 Rantes以及特别是TNF-a基因表达的抑制特 别适用于在未受刺激的原代免疫细胞中检测GR配体的反式阻抑活性。已 经证实谷氨酰胺合成酶和GILZ表达的诱导以及非常特别是CD163和 FKBP51表达的诱导特别适用于检测反式激活活性。利用所述参数，可能表征选择性GR配体或标准糖皮质激素在体外和 在体内施用后对GR的反式激活或反式阻抑活性的激动和拮抗效应。这些 参数用于表征GR配体的分子机制的用途是新的。可以从使用未受刺激的原代免疫细胞中的基因和/或蛋白质表达分析 来检测GR配体的分子机制预期以下优点1) 原代免疫细胞是与GR配体在生物中的活性有很大相关性的非人 工细胞系统。2) 检测未受刺激的原代免疫细胞中的参数避免可能歪曲参数和不 能反映生物中状况的刺激的必要性。3) 研究证实所述原代免疫细胞中的参数以快速、剂量依赖性、可重 复和一致的方式反映在体外添加后和在体内给药后GR配体的分子机制。4) 在未受刺激的原代人免疫细胞上获得的体外结果和在GR配体体 内给药后的动物试验研究中获得的结果之间非常好的一致使得非常有可 能将确定的参数应用于人体体内研究。5) 未受刺激的原代免疫细胞中参数的可检测性也允许直接测定用 GR配体处理的生物的血样中的参数。因此，容易得到用于体内研究的研 究材料。6) 可以在用GR配体处理的生物的血样中测定所述参数，而不引起 取血方面的额外应激。用于给药相应的GR配体和用于取血的额外干预不 是必需的。用于研究的绝对必需的血液体积少于1毫升。7) 可以在全血测定法中检测所述参数，因此不发生例如细胞分离造 成的结果损害。在这方面，可以得到可商购的检测系统。8) 所述未受刺激的原代免疫细胞中参数的检测可以被用于试验性 的体外和体内研究以及用于I期和临床研究。在这方面，在GR配体的发现、开发和临床使用中，GR配体分子机制的参数一致是可能的。9) 所述参数适用于在人体研究中作为用于表征GR配体的体内分子 机制的生物标记物。10) 被选择的反式阻抑参数(抑制IL-1|3、 IL-8、 Rantes以及特别是 TNF-oc炎症介质的表达)还允许表征GR配体的抗炎和免疫调节作用。11) 因为反式激活和反式阻抑活性决定性地决定GR配体在生物中的 作用，因此表征外周血的未受刺激的原代免疫细胞中确定的基因和/或蛋白 质表达参数可以帮助甚至在早期研究以及甚至在健康人(例如I期研究)中 获得体内分子机制的信息，从而获得期望的GR配体的作用/副作用谱。本专利中的原代免疫细胞均为活生物的免疫细胞。具体地指血液、骨 髓和淋巴器官(例如胸腺、脾、淋巴结、派伊尔淋巴集结(Peyer，s plaque)) 中的免疫细胞。血液中的免疫细胞是非常特别优选的。方法原理本专利技术描述了通过分析原代免疫细胞中GR敏感基因的基因和蛋白质 表达表征糖皮质激素受体(GR)配体(标准糖皮质激素和选择性GR配体)的 分子机制。选择性GR配体代表新一类GR配体，其不同程度地采用基因表达的 GR介导的调节、敏感基因的反式激活或反式阻抑两种机制。它们可以是 相应机制的激动剂、部分激动剂、部分拮抗剂和拮抗剂。对应于GR介导 的抗炎、免疫抑制和代谢作用，选择性GR配体的适应症可以是例如炎性 疾病或具有改变的代谢活性的病症。对于这样的新GR配体的发现、成功开发和临床使用而言，基本要求是表征其在相关体外和体内试验以及在I 期和人体临床研究中的分子机制。在试验性体外或体内研究以及在I期和人体临床研究中，所述方法的 目的是通过未受刺激的免疫细胞、淋巴器官和血液中基因和/或蛋白质表达或蛋白质释放的改变表征选择性GR配体和标准糖皮质激素的反式阻抑和 反式激活活性。为此，在从50多个基因的筛选中选择参数，并进行更为 详细的分析。基本选择标准是l)基因调节与选择性GR配体的反式阻抑或 反式激活活性之间的相关性，2)在未受刺激的原代免疫细胞中的一致基因 调节，和3)在体外测定中的快速反应以及在体内给药GR配体后良好和持 久的可检测性。这些标准对于所述参数用作生物标记物是基本的。在体外检测和离体检测中，已经证实促炎IL-lf3、 IL-8、 Rantes以及特 别是TNF-oc细胞因子的抑制都特别适用于表征反式阻抑活性，且已经证实 谷氨酰胺合成酶和GILZ的诱导以及非常特别是CD163和FKBP51的诱导特别适用于反式激活活性。其他合适的参数是用于检测反式阻抑的共辅助分子(co-accessoiy molecules) (HLA-DR、 CD86)的表达和用于检测反式激活活性的细胞因子 受体(IFN画yRl、 TNF-R1、 IL-1R1、 IL-2Ra、 IL-13Ra、 CXCR4、 GITR)及 其他基因(P2-肾上腺素受体、血红素加氧酶1 (hemoxygenase 1)、IL-2、MIF、 膜联蛋白1、血小板反应蛋白l)的表达。可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于通过ＧＲ敏感基因的基因和／或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体（ＧＲ）配体的反式激活和反式阻抑活性的方法，其中进行以下步骤：　　　　ａ）将原代免疫细胞暴露于ＧＲ配体；　　　　ｂ）检测至少一种ＧＲ敏感基因的表达调节以测定所述反式阻抑；　　　　ｃ）检测至少一种ＧＲ敏感基因的表达调节以测定所述反式激活；　　　　ｄ）通过参考已知糖皮质激素将所得值归一化；　　　　ｅ）根据公式１导出比值：　　　　＊＊＊。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：WD德克，C伦奇，H沙克，N施密斯，H雷温克尔，B舒尔茨，P戈勒茨，C施托克，
申请(专利权)人：拜耳先灵医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]