本发明专利技术涉及一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法为：第一步，制备酶标抗原、黄曲霉毒素ＡＦＢ↓［１］标准溶液、样品稀释液、酶标抗原稀释液、洗涤液制备底物液ａ、底物液ｂ、终止液即２ｍｏｌ／Ｌ硫酸液和提取液，第二步，进行待测液前处理、试剂准备、反应板试管编号、依次加入配置好的溶液、待测样液和终止液，反应板装入用黄曲霉毒素测定仪测定各孔的吸光度Ａ值；将测得的吸光度Ａ值，黄曲霉毒素测定仪内自动建立方程Ａ＝ＭＣ＋Ｎ回归计算，计算出样品中ＡＦＢ↓［１］的含量。本发明专利技术的优点是简便、快速、准确、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物工程中免疫酶
技术介绍
黄曲霉毒素(简称AFT)是一种真菌毒素，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生 的一种强毒性的次生代谢产物，现已査明凡能孽生黄曲霉真菌的物质，如粮食、 油料作物的种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、黄麻、乳类、乳制品、肉 类、鱼奸类、发酵品类和饲料中均有AFT的污染。AFT理化性质非常稳定，在高温20(TC及紫外线照射下，都不被破坏而且通 过食物链的作用能从一种生物体转移到另一种生物体内，凡残留在家禽、家畜的 肉、内脏、蛋、奶中毒素可随食物进入人体导致人类中毒或致癌，据世界卫生组 织及上海市肿瘤研究所等有关部门报导黄曲霉毒素是引起肝癌的首位致癌因素， 因此世界上许多国家对食品中黄曲霉毒素允许量都做了严格的限制。我国规定词 料和食品中黄曲霉毒素的允许值分别小于50PPb和20PPb，这就要求测定方法要 有很高灵敏度。目前测定方法大致有化学分析法、仪器分析法、生物鉴定法以 及酶联免疫吸附法(ELISA)。化学分析法中以薄层层析法最为常用，也作为我国对食品、词料中黄曲霉毒 素测定的国标法，其检测限为l-5PPb，但其检测时必须要用己知黄曲霉毒素标 准品作对照，必要时通过用生物法作补充证实。仪器分析法一般用高效薄层层析扫描仪或高效液相色谱法，其自动化程度高 分辨率好，但仪器较昂贵，技术水平要求高，难以普及推广应用。生物鉴定法由于特异性较差，灵敏度低， 一般只作化学分析法的补充验证。 以上三种方法样品前处理都较复杂，要提取与净化，排除样品中其它物质干扰以 致特异性不强。美国拉韦林(Lawellin)首先提出酶联免疫吸附分析法来测定黄曲霉毒素中毒性最强的结构I^ (羧甲基肟)来定性、定量黄曲霉毒素含量。目前国内外都以 黄曲霉中毒性最强的结构B,做为检控主要对象。由于此法特异性高，分析时间 短，受到广泛的重视，后来有人又研究出用酶联免疫吸附分析法的"药盒"，一 盒试剂可测多个检测样品，"药盒"在美国有购买，但价格也比较昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用简易、价廉、 一体化的准确、快速检测黄曲霉 毒素的方法。为实现以上目的，本专利技术的技术方案是提供一种准确、快速检测黄曲霉毒素 的方法，其特征在于，其方法为一.标准试样制备 第一步，制备黄曲霉毒素AFB,抗体包被反应板将抗黄曲霉毒素AFBt多克隆抗体用50ramol/L — 100mmol/L ， Na2C03-NaHC03PH9. 6缓冲液稀释至3_5Pg/ml的包被液，加入到反应板的 48或96孔的试管中，每孔加100—110叱，3"C — 5。C冰箱放置过夜，弃 去包被液冲洗2次一4次，每孔中加200—250化含1%牛血清白蛋白BSA 的100 —110mmol/L 、 ffl7. 4磷酸盐PBS缓冲液封闭35。C一40。C放2 — 4 小时，弃其封闭液，将包被板真空包装后置-15T:—-25t:冷冻保存； 第二步，制备酶标抗原取0. 5 lmg黄曲霉毒素Bi—羧甲基肟AFB「omixe溶于20%乙醇溶液中， 加入20-50mg乙二胺3. 3-二甲胺丙基碳化二亚胺盐酸盐EDC HCL搅拌 反应30分钟一60分钟，再以磷酸盐PBS 0. 01M、 ffl7. 4溶液透析2天 一4天，得到酶标抗原原液； 第三步，制备黄曲霉毒素AFBi标准溶液将10%-20%甲醇的磷酸盐PBS PH7.4溶液为溶剂，配制0. lng/ml — 10ng/ml的AFB^示准系列溶液； 第四步，制备样品稀释液在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入l(m—2(^甲醇； 第五步，制备酶标抗原稀释液在磷酸盐PBS PH7. 4溶液中加入0. 05 — 0. 2%的牛血清白蛋白BSA;第六步，制备洗涤液在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入0.03。/。一0. 07%的吐温-20 TW-20; 第七步，制备底物液a:在乙酸钠——柠檬酸缓冲液PH=5.0中加入0. 1%—0.4%四甲基联苯胺TMB;第八步，制备底物液b:在乙酸钠一柠檬酸缓冲液PH=5. 0中加入0. Ol—O. 03%过氧化氢H202; 第九步，制备终止液即2mol/L硫酸液； 第十步，提取液即甲醇水为h 1; 二，检测第一步，待测液前处理，称取5g粉碎过20目筛的样品于磨口的50ml试管中，加入提取液 20 — 30ml，加塞振荡5分钟一10分钟，过滤即为待测样液； 第二步，试剂准备在标准试样制备第二步准备的酶标抗原原液中加l一2ml酶标抗原稀 释溶液，充分溶解，配成酵标抗原工作溶液； 第三步，试管编号根据实验需要将反应板框架上的试管编号，设定1号试管为 仪器凋零试管，2-7号试管为黄曲霉毒素AFBi标准对照试管，其余试管 为样品试管； 第四步，依次加入配置好的溶液及待测样液(1) ，在1号试管中加入40 — 6(mL样品稀释液，在2-7号试管中分别加入黄曲霉毒素AFBi标准溶液40 — 60化，在其余试管中分别加入待测样液；(2) ，在1号试管中加入40—60叱酶标抗原稀释液，其余试管中分别加入40一60化酶标抗原工作溶液，轻轻地振荡，使各试管中的反应物混匀；(3) ，然后将反应板放入35X:—4(TC恒温培养箱中孵育20分钟一40分钟；(4) ，取出反应板，甩掉反应液，拍干，每试管加入200PL—300叱洗涤液，放置1分钟一3分钟后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板3 — 5次;(5) ，在每试管中分别加入底物液a和底物液b各50叱，摇匀，将反应板放入35。C一4(TC恒温培养箱中，显色10分钟一20分钟；(6) ，取出反应板，在每个试管中分别加入终止液40—60PL，用黄曲霉毒素测定仪在360mm-450mm波长处测定各孔的吸光度A值；(7) ，将测得的吸光度A值，黄曲霉毒素测定仪内自动建立方程A二MC+N回归计算，计算待测样品孔A值与A。n^的比值，査标准曲线，可得到相应待测样 液浓度C的常用对数值LgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFB1浓度 C，按下列公式计算出样品中AFB1的含量AFB!含量(~/紐)=-式中C--一从标准曲线上査得的AFBi的含量(ng/ml) F-—样品提取液体积(ml); 仏-一样品稀释倍数； ^-一样品的质量(g)所述的黄曲霉毒素测定仪包括单片机和稳压电源，所述的单片机分别与只读 存储器、键盘、显示器、随机存储器、接口和数码转换器连接，数码转换器通过 前置放大器与模数转换器连接，模数转换器通过接口和打印驱动与打印机连接， 稳压电源通过光源与干涉滤光片连接，干涉滤光片通过样品池与硅光电池连接， 硅光电池与前置放大器连接。本专利技术先用含黄曲霉毒素特异抗体的免疫球蛋白附着于载体表面，含抗原溶 液和酶标记抗原溶液以不同比例混合，然后与致敏的载体表面保温，再通过酶的 特殊底物的水解量来确定未知液中是否有黄曲霉毒素及含量，酶底物水解量就由 测定仪器进行计数含量。物质中的原子和分子所含能量以多种方法与相互作用而产生对光的吸收效 应，而物质透光率变化与被测物质浓度有一定的函数关系，在一定范围内它符合 郎伯——比耳定律。因此在测定仪器内计算机即可根据郎伯——比耳定律，设有 一个线性回归方程A=MC+N的计算程序，所以只要输入标准试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法为 一．标准试样制备 第一步，制备黄曲霉毒素ＡＦＢ↓［１］抗体包被反应板： 将抗黄曲霉毒素ＡＦＢ↓［１］多克隆抗体用５０ｍｍｏｌ／Ｌ－１００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］－ＮａＨＣＯ↓［３］ＰＨ９．６缓冲液稀释至３－５μｇ／ｍｌ的包被液，加入到反应板的４８或９６孔的试管中，每孔加１００－１１０μＬ，３℃－５℃冰箱放置过夜，弃去包被液冲洗２次－４次，每孔中加２００－２５０μＬ含１％牛血清白蛋白ＢＳＡ的１００－１１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＨ７．４磷酸盐ＰＢＳ缓冲液封闭３５℃－４０℃放２－４小时弃其封闭液将包被板真空包装后置－１５℃－－２５℃冷冻保存； 第二步，制备酶标抗原： 取０．５～１ｍｇ黄曲霉毒素Ｂ↓［１］－羧甲基肟ＡＦＢ↓［１］－ｏｍｉｘｅ溶于２０％乙醇溶液中加入２０－５０ｍｇ乙二胺３．３－二甲胺丙基碳化二亚胺盐酸盐ＥＤＣ.ＨＣＬ搅拌反应３０分钟－６０分钟，再以磷酸盐ＰＢＳ０．０１Ｍ、ＰＨ７．４溶液透析２天－４天，得到酶标抗原原液； 第三步，制备黄曲霉毒素ＡＦＢ↓［１］标准溶液 将１０％－２０％甲醇的磷酸盐ＰＢＳ ＰＨ７．４溶液为溶剂配制０．１ｎｇ／ｍｌ－１０ｎｇ／ｍｌ的ＡＦＢ↓［１］标准系列溶液； 第四步，制备样品稀释液 在磷酸盐ＰＢＳ ＰＨ７．４溶液中加入１０％－２０％甲醇； 第五步，制备酶标抗原稀释液 在磷酸盐ＰＢＳ ＰＨ７．４溶液中加入０．０５－０．２％的牛血清白蛋白ＢＳＡ； 第六步，制备洗涤液 在磷酸盐ＰＢＳ ＰＨ７．４溶液中加入０．０３％－０．０７％的吐温－２０ＴＷ－２０； 第七步，制备底物液ａ： 在乙酸钠－柠檬酸缓冲液ＰＨ＝５．０中加入０．１％－０．４％四甲基联苯胺ＴＭＢ； 第八步，制备底物液ｂ： 在乙酸钠－柠檬酸缓冲液ＰＨ＝５．０中加入０．０１－０．０３％过氧化氢Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］； 第九步，制备终止液即２ｍｏｌ／Ｌ硫酸液； 第十步，提取液即甲醇∶水为１∶１； 二，检测 第一步，待测液前处理， 称取５ｇ粉碎过２０目筛的样品于磨口的５０ｍｌ试管中，加入提取液２０－３０ｍｌ，加塞振荡５分钟－１０分钟，过滤即为待测样液； 第二步，试剂准备： 在标准试样制备第二步准备的酶标抗原原液中加１－２ｍｌ酶...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘中华，成恒嵩，赵晓联，葛其德，
申请(专利权)人：上海纤检仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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