本发明专利技术公开了一种检测子宫内膜异位症的方法，属于医学检验领域。一种检测子宫内膜异位症的方法，通过测定受试者子宫内膜组织或血清中ＧＲＥＭ１蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。本发明专利技术的优点：本发明专利技术首次揭示了ＧＲＥＭ１蛋白表达量与子宫内膜异位症的关系，从而提供了一种有效检测子宫内膜异位症的标记物。本发明专利技术检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒，采用ＥＬＩＳＡ定量测定受试者血清中ＧＲＥＭ１蛋白的含量，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品，检测方法简便易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒，属于医学检验领域。技术背景子宫内膜异位症(Edometriosis， EM)是子宫内膜组织异位在子宫腔以外并且引 起病变，是一种常见病、多发病，引起盆腔疼痛、性交痛及不孕等，严重影响妇女的 身心健康。发病率在15%-20%，在不孕妇女中占30%-50%。其发病机制尚不完全清楚， 有诸多学说如子宫内膜种植学说、免疫学说、淋巴及静脉播散学说、体腔上皮化生学 说等，但均不能完全解释内异症的发病。基础研究表明，血管形成和免疫学的异常在EM的病理发生中发挥重要的作用。 沙桂华等的研究表明，与非EM来源的微血管内皮细胞相比，EM患者在位内膜来源 的微血管内皮细胞在体外分离培养的过程中表现出了明显增强的存活能力。分子水平 的研究显示，与非EM正常对照的在位内膜相比，Gremlin 1(GREM1 ， Genbank AF110137)在这种细胞中的表达明显增强。GREM1是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins ， BMPs)的拮抗剂家族成员 之一，是一含有184个氨基酸残基的分泌型蛋白质，分子量为20697 Da，在生物进化 过程中具有高度的保守性，在人和大鼠、小鼠、鸡及爪哇属之间其氨基酸序列高度同 源。它能与特定的BMPs成员结合(尤其是BMP-2、 -4、 -7)，形成异二聚体，抑制BMPs 与其受体结合，产生拮抗作用。它既存在于细胞内质网和高尔基体管腔中，也存在于 细胞表面，以非共价键形式与细胞膜相连。有糖基化和非糖基化两种形式，二者均能 拮抗BMPs的活性。GREM1主要在胚胎期的组织器官中表达，能够调节肢体的生长，抑制软骨发生 和细胞的凋亡，对四肢、神经、肾、肺、皮肤、羽毛、耳等组织器官的发育起着重要 的作用。它也存在于成年期的人和动物组织中，人体多种组织中也有gennlin的表达, 在小肠、结肠及胚胎脑中有高表达，在成人脑、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌中弱表 达。对成年人疾病的研究中，认为GREM1与糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、青光 眼、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化，甚至肿瘤的发生都有密切关系。在这些纤维化 疾病中GREM1与促进上皮-间充质转化，抑制上皮细胞再生有关。在妇产科领域的研究主要集中于，它在卵巢中由卵母细胞和颗粒细胞表达，通过旁分泌的作用调节性激 素产生。子宫内膜组织中有无GREM1的表达，与子宫内膜异位症有无关系国内外尚 未有相关的报道。鉴于上述对内异症发病的新认识，本专利技术选择与促新生血管形成有关的蛋白 GREM1为研究对象，首次揭示了该蛋白与内异症的关系，并成功开发出了检测子宫 内膜异位症的方法和试剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测子宫内膜异位症的方法。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种用于检测子宫内膜异位症的酶联免 疫吸附测定试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种检测子宫内膜异位症的方法，测定受试者在位子宫内膜组织或血清中GREM1蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。参考的检测指标外周血血清中蛋白含量》700ng/ml时，推测患有子宫内膜异位症。根据本领域的公知常识，获知了 GREM1蛋白能够作为子宫内膜异位症的标记物， 可采用多种方法检测其表达水平从而进行疾病的诊断。所述检测子宫内膜异位症的方 法可以是Western Blot法、化学发光法、酶联免疫法或PCR法(优选RT-PCR)，前三 种方法在蛋白质水平检测GREM1蛋白的表达量的变化，PCR法可在基因水平进行检测。本专利技术采用蛋白质免疫印迹法(Western blot analysis),证明了促血管形成因子 --GREM1蛋白在子宫内膜中有表达。进一歩比较了子宫内膜异位症(EM)患者的在 位子宫内膜组织与非子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织中表达水平的差异，结果显 示GREM1蛋白在内膜异位症患者的在位子宫内膜组织中的表达量高于非内膜异位症 患者的子宫内膜。我们对两组患者的在位子宫内膜组织的GREM1 mRNA水平的研 究结果，显示在EM患者的在位子宫内膜组织中GREM1 RNA水平较non-EM患者 明显增高(P0.05)，提示我们EM患者与non-EM患者的在位子宫内膜组织中GREM1 RNA及蛋白水平的表达都是存在的，两组之间有明显差异，EM患者的在位子宫内膜 组织中存在着更多的GREM1。将其中两名妇女的血清去除高丰度蛋白后进行免疫印 迹，其中EM患者较non-EM患者的条带灰度值明显升高。这个结果为我们采用酶联 免疫法检测疾病和开发酶联免疫检测试剂盒提供了依据。本专利技术优选酶联免疫法测定受试者血清中GREM1蛋白的表达水平，步骤如下1. 包被用包被液0.02 mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液将GREM1单克隆抗体稀 释至蛋白质含量为1 1(Hig/ml，在聚苯乙烯板的每个反应孔中加100ul，置4。C过夜； 次日弃去孔内溶液，用洗涤液PBST洗涤1~3次，拍干；2. 封闭加入封闭液(5%脱脂奶)200ul， 37'C封闭2小时，用洗涤缓冲液PBST 洗涤1 3次，弃去孔内溶液，拍干；3. 加样每孔加入50ul待检样品(未稀释的血清)和用0.5%脱脂奶稀释的终浓 度为0.2 ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul， 37T共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST 洗涤3 5次，弃去孔内溶液，拍干；标准曲线每孔加入50ul标准品，浓度为Oppb、 100卯b、200ppb、400ppb、800ppb和1200卯b，和用0.5%脱脂奶稀释的终浓度为0.2ug/ml 的GREM1多克隆抗体50ul， 37'C共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤3~5次， 弃去孔内溶液，拍干；4. 加酶标抗体每孔加入用0.5%脱脂奶1: 3000稀释的HRP-羊抗兔IgG 100 ul， 37'C孵育30min后PBST洗涤5次，弃去孔内溶液，拍干；5. 显色反应每孔加入TMB (四甲基联苯胺)使用液100ul，显色15min;6. 终止反应每孔加入50ul2mol/LH2SO4终止反应；7. 结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测定各反 应孔的OD值；以不同浓度的标准品吸光度值为横坐标、GREM1浓度为纵坐标进行 线性拟合，得线性回归方程，根据回归方程测定样品中蛋白含量。血清蛋白含量》700 ng/ml时，推测患有子宫内膜异位症。本专利技术使用的抗体可以通过商业途径获得，也可以实验室制备。多克隆抗体和单 克隆抗体的制备方法为本领域公知技术。一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，由以下试剂组成，2 8'C避光保存1. 48或96孔聚苯乙烯板；2. GREM1小鼠单克隆抗体(謂026585掘7)， Abnova公司;3. GREM1兔多克隆抗体(sc-28873)， santacruz公司;4. 酶标抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG， santacruz公司；5. GREM1标准品用PBS稀释，浓度为Oppb、 100ppb、 200ppb、 400ppb、 800卯b 和1200ppb; (recombinant mouse GREM1 ， 956-GR/CF)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测子宫内膜异位症的方法，其特征在于：通过测定受试者子宫内膜组织或血清中ＧＲＥＭ１蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沙桂华，郎景和，
申请(专利权)人：沙桂华，郎景和，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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