本发明专利技术提供了一种检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶联板；酶标记物；呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体；呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；浓缩复溶液。呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明专利技术还提供了一种检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的方法，包括了以下步骤：样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本发明专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测动物源性食品呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测分析动物源性食品中兽药残留的技术，特别是检测呋喃 西林的酶联免疫试剂及方法。
技术介绍
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应 用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现， 硝基呋喃类药物和代谢物(SEM)均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因 为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用，呋喃西林在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则 能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产 物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。用来检测呋喃西林代谢物的最常用方法是LC-UV， LC-MS和LC-MS/MS， 但是这几种方法检测相对繁琐，对仪器要求较高，不适合大量样本的快速检测。 酶联免疫方法结合了色谱技术，采用SEM衍生物的特异性抗体，具有很高的准 确度和灵敏度，并且操作简便、检测时间短、检测样本量大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及方法。本专利技术的检测原理当包被原为呋喃 西林代谢物衍生物偶联抗原时是将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白偶联物(SEM-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或呋喃西林代谢物衍生物 标准品，然后加呋喃西林代谢物特异性抗体，待测样品中残留的呋喃西林代谢物 (经前处理衍生化以后)和酶标板上包被的呋喃西林代谢物衍生物抗原竞争呋喃 西林代谢物衍生物特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显 色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃西林代谢物残留量呈负相关， 与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物的浓度。包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入呋喃西林代谢物衍生 物特异性抗体，再加入呋喃西林代谢物衍生物酶标记抗原和样本或呋喃西林代谢 物衍生物标准品溶液，待测样本中残留的呋喃西林代谢物(经前处理衍生化以后) 和酶标记呋喃西林代谢物衍生物抗原竞争呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体，显 色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃西林代谢物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物的浓度，与标准溶液颜色比较则可 判断样品中呋喃西林代谢物的浓度范围。本专利技术提供了一种检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒， 它含有(1) 包被呋喃西林代谢物衍生物抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2) 酶标记物；(3) 呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体；(4) 呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液；(5) 底物显色液；(6) 终止液；(7) 浓縮洗涤液；(8) 浓縮复溶液。本专利技术所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋 喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠 抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进 行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得 到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为pH值9.6、 0.05mol/L的碳酸盐缓冲 液;包被呋喃西林代谢物衍生物抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、 聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载 体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有 0.1%~0.5%吐温80， 0.5%叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭 液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本专利技术所述试剂盒中包被呋喃西林代谢物衍生物抗原的酶联板或包被抗抗 体的酶联板的制备步骤为(1) 用包被缓冲液将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白(BGG)偶 联物或抗抗体以0.02~0.08pg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；(2) 向酶联板的每孔中加入100^1已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液， 37'C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15 30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150 200nl封闭液，37'C温育l 2h，倾去孔内液 体，干燥后用铝膜真空密封保存。以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的 相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。本专利技术所述试剂盒中酵标记物为酶标记抗抗体或酶标记呋喃西林代谢物衍 生物抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本专利技术优选过氧化物酶；酶标 记物形式可为冻干粉、浓縮液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有 50n/。甘油(可防止放入-2(TC环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生 物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为(1) 抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊迸行免疫，得到 羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔 抗抗体。(2) 过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA—步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且 偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的 缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂 活化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂，通过改 变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶连效率提高， 而且形成的同分子聚合物减少。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与呋喃西林代谢 物半抗原进行偶联得到。本专利技术所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体为鼠源单克隆抗体 或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥 孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀 释液为pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN，N，-二甲基甲酰胺(DMF) 的磷酸盐缓冲液。本专利技术所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体可为单克隆抗体或 多克隆抗体，其制备方法如下(l)呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体制备的步骤为a.动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(呋喃西林代谢物 衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80 100pg/只，首免时将免 疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹 腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；b.细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5 10: 1比例与SP2/0 骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有 限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；C.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l 5xl06个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立 即放入37'C水浴中速融，离心去除冻存液后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种呋喃西林代谢物（ＳＥＭ）快速检测试剂盒，包括： （１）包被有包被原的酶联板； （２）酶标记物； （３）呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体； （４）呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液； （５）底物显色液； （６）终止液； （７）浓缩洗涤液； （８）浓缩复溶液； 所述酶联板中包被的包被原为呋喃西林代谢物衍生物抗原或包被抗抗体，其特征在于：呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，多克隆抗体为呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物免疫鼠或者兔得到，单克隆抗体采用细胞融合和克隆化得到，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂继斌，唐俊，杨宏，温俊梅，齐欣，吴青，李成，杨宗繁，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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