酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用制造技术

本发明专利技术公开了烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白（蛋白序列如SEQ ID NO.2所示）和其编码基因

【技术实现步骤摘要】
酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及烟粉虱酚糖酰基转移酶基因、其特异性dsRNA以及转基因表达特异性dsRNA的植物在防控烟粉虱中的应用。
技术介绍
烟粉虱是世界性的入侵害虫，其寄主非常广泛，包括600余种作物和观赏植物，烟粉虱通过取食韧皮部汁液、分泌蜜露和传播多种植物病毒等方式对世界范围内的农作物造成严重危害。长期以来烟粉虱的防治主要依赖于化学杀虫剂，然而，化学杀虫剂的大量使用导致烟粉虱已经对多种杀虫剂产生了抗药性，同时长期使用杀虫剂导致了非靶标生物的存活率下降、环境污染等一系列问题，对人类的食品安全造成严重威胁。因此，人们迫切需要高效、低毒、靶标特异性的策略来防治害虫，从而实现农业的可持续发展。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA,简称dsRNA)介导的基因沉默现象，自RNA干扰现象在秀丽隐杆线虫中被发现以来，该技术被广泛应用于基因功能研究，并于2006年获得了诺贝尔奖。2007年NatureBiotechnology杂志发表了两篇利用转基因技术特异性表达dsRNA用来防治玉米根叶甲和棉铃虫的文章，为农作物的害虫防治提供了新的策略。RNA干扰的方法防治害虫具有对环境友好、杀虫专一性强、对非靶标生物无害等优点。筛选出对目标害虫具有高致死作用的靶基因是RNA干扰方法应用于害虫防治的先决条件。酚糖是植物中含量最丰富的一类次生代谢产物，对多种食草性生物具有毒性。植物中的酚糖能够严重影响昆虫的生长发育和取食行为，甚至造成昆虫的死亡。烟粉虱通过水平基因转移的方式获得了植物的酚糖酰基转移酶(BtPMaT1)基因，并可通过该基因代谢酚糖，从而克服植物中酚糖对烟粉虱的毒害作用。因此，以烟粉虱的BtPMaT1为靶标，通过转基因等方法抑制该基因在烟粉虱中的表达，增加烟粉虱对酚糖的敏感性，能够实现对烟粉虱的有效防治，具有极其重要的商业价值和广泛的应用前景。
技术实现思路
针对现有化学防治技术中存在的不足，本专利技术提供一种烟粉虱酚糖酰基转移酶BtPMaT1基因序列，及其dsRNA在防治烟粉虱中的应用，相比于其他化学杀虫剂，具有高效低毒，对环境友好等优点。本专利技术提出植物次生代谢产物kaempferol3-O-glucoside、kaempferol7-O-glucoside,和rhaponiticin能够防治烟粉虱。本专利技术提供烟粉虱酚糖酰基转移酶BtPMaT1基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其获得方法如下：(1)以烟粉虱的基因组数据为基础，筛选其中的水平转移基因（HGT），得到一个预测的植物源酚糖酰基转移酶基因；(2)将该预测基因与烟粉虱的转录组数据进行比对，校正该基因序列；(3)设计特异性的引物克隆得到烟粉虱的BtPMaT1基因全长序列。该序列全长1515bp，包含一个1386bp的开放阅读框(ORF)，编码461个氨基酸的蛋白，其编码蛋白序列如SEQIDNO.2所示，还包括31bp的5′-UTR和92bp的3′-UTR。本专利技术还提供了烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的dsRNA，包含酚糖酰基转移酶基因的片段(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列SEQIDNO.1设计含有T7启动子的特异性引物；(2)以烟粉虱成虫的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增；(3)回收PCR产物，通过T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Promega,Madison,WI,USA)试剂盒合成dsRNA。本专利技术还提供了表达烟粉虱酚糖酰基转移酶基因dsRNA片段(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)的转基因植物。所述植物优选为单子叶，或双子叶植物，优选为农作物，更优选为番茄、烟草棉花、木薯、黄瓜等。其获得方法如下：(1)根据核苷酸序列SEQIDNO.1设计含有限制性酶切位点的特异性引物；(2)以烟粉虱成虫的cDNA为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增；(3)利用特异性的核酸内切酶切割PCR产物和植物RNAi表达载体；(4)用T4连接酶将PCR产物连接到植物RNAi表达载体上；(5)将构建好的RNAi表达载体转入农杆菌中；(6)利用上述农杆菌侵染番茄，构建表达dsBtPMaT1的转基因番茄。本专利技术还提供含有序列如SEQIDNO.1所示编码基因的表达盒、表达载体、重组细胞系。本专利技术的目的在于提供了上述的序列、各种载体、转基因植物等应用于烟粉虱的防治。目前人们主要是利用化学农药防治烟粉虱，一方面烟粉虱已经对多种化学农药产生了很高的抗药性，另一方面也容易对环境造成污染。酚糖是植物中广泛存在的次生代谢产物，利用其对食草性害虫具有毒性的特点，可以实现害虫的绿色防控。本专利技术公开了烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白和其编码基因BtPMaT1，及其双链RAN(dsRNA)的应用，dsRNA可以特异性沉默BtPMaT1基因使烟粉虱对酚糖苷类植物次生代谢产物更加敏感，同时，转基因植物表达dsRNA能够特异性沉默烟粉虱BtPMaT1基因，并导致烟粉虱的死亡。本专利技术还公开了BtPMaT1基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，用于dsRNA的合成和转基因植物表达载体构建，该dsRNA的摄入能够使酚类物质对烟粉虱成虫致死作用增强，取食表达dsBtPMaT1的转基因番茄能够导致烟粉虱成虫的死亡。本专利技术通过RNAi技术干扰烟粉虱酚糖酰基转移酶基因，增加了烟粉虱对酚糖类代谢产物的敏感性，实现了对烟粉虱的有效防控。本专利技术为RNA干扰和转基因的方式防治田间烟粉虱提供了新的靶标，具有明显的商业价值和广泛的应用前景，其特点在于(1)靶标基因仅存在于烟粉虱中，具有高度的害虫专一性，对非靶标生物安全；(2)利用植物的次生代谢产物防治烟粉虱，对环境无污染。附图说明图1：酚糖kaempferol3-O-glucoside、kaempferol7-O-glucoside,和rhaponiticin对烟粉虱成虫的致死作用。*表示饲喂液中添加酚糖的处理组烟粉虱与不添加酚糖的对照组烟粉虱的成虫死亡率存在显著性差异(P>0.05;Holm-Sidak’stest;n=3)。图2：在烟粉虱取食的饲喂液中添加SEQIDNO.3合成的dsRNA，待烟粉虱取食48h后，利用qPCR的方法测定烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的表达量，以dsEGFP处理的烟粉虱为对照，确定dsRNA对靶标基因的干扰效率(A)；干扰烟粉虱酚糖酰基转移酶48h后，测定kaempferol3-O-glucoside(B)、kaempferol7-O-glucoside(C),和rhaponiticin(D)对烟粉虱成虫的致死作用。dsEGFP的为实验对照处理，不同的字母表示不同处理间存在显著性差异(P>0.05;Holm-Sidak’stest;n=3)。图3：烟粉虱取食转基因番茄1d，3d，5d，7d时，利用qPCR的方法测定烟粉虱酚糖酰基转移酶基因的表达量，以非转基因番茄为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白的编码基因。


3.根据权利要求2所述的烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.一种烟粉虱酚糖酰基转移酶的dsRNA靶向基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.含有如权利要求2或3所示的编码基因的表达盒、表达载体、重组细胞系。


6.一种靶向如权利要求2或3所述的烟粉虱酚糖酰基转移酶蛋白的编码基因的dsRNA。


7.如权利要求6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张友军，夏吉星，郭兆将，杨泽众，吴青君，王少丽，谢文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11