本发明专利技术公开了PARP15蛋白与其抑制剂3‑氨基苯甲酰胺复合物晶体及其制备方法，包括如下步骤：把PARP15蛋白与其抑制剂3‑氨基苯甲酰胺按比例混合；再把所得混合物采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到PARP15蛋白与其抑制剂3‑氨基苯甲酰胺复合物晶体。本发明专利技术优点有：成功获取高纯度的PARP15蛋白，并且首次获得该蛋白与其抑制剂3‑AB复合物晶体，能够促进关于PARP15蛋白的研究，为靶向PARP15蛋白药物设计、优化提供分子基础。
【技术实现步骤摘要】
PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体及其制备方法
本专利技术涉及蛋白质结晶
，尤其涉及PARP15蛋白结晶技术。
技术介绍
PARP15蛋白(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族成员15)在弥漫性大B细胞淋巴瘤中过表达。研究报道，PARP15蛋白具有甲基化活性。由于肿瘤抑制基因(TsGs)通常是通过体细胞突变和/或启动子甲基化失活，因此PARP15蛋白对肿瘤具有抑制作用。目前，关于PARP15蛋白的研究较少，对其生物学功能的研究更是少之甚少。但PARP家族对癌症影响甚大，并且有学者认为PARP15蛋白是癌症发展的候选基因，具有调节基因转录的能力。此外，据报道它与细胞凋亡有关。蛋白质的三维结构在了解其生物功能以及针对靶标蛋白质的小分子药物研究中起到了非常重要的作用，而蛋白质结晶又是其研究的主要难点。蛋白质结晶可以快速解析蛋白质-配体或先导化合物复合物的晶体结构，帮助人们理解小分子如何与蛋白质结合，并利用其相关结构信息设计新的药物分子。因此，获得高质量的蛋白质晶体是解析蛋白质三维结构的首要解决的问题。蛋白质晶体是在饱和溶液中慢慢产生，每一种蛋白质培养晶体的条件皆有所差异，影响晶体形成包含化学上、物理上、生化上的多个变量。迄今为止，除已有大量经验累积外，还没有发现蛋白质的结晶条件与其结构之间有明显的相关性，也没有任何一套实验系统或理论可以预测结晶的条件，必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可获得一颗完美的单一晶体。若要了解PARP15蛋白的生物学功能以及促进靶向PARP15蛋白药物的设计，需要一种获得高纯度PARP15蛋白和高质量PARP15蛋白结晶的方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成功获得PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)复合物晶体的方法，以解决现有技术中未能获得PARP15蛋白结晶、缺少对该蛋白研究基础的问题。为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：一种PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)把PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺按比例混合；(2)把(1)所得混合物采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体。进一步地，所述PARP15蛋白的浓度为5～10mg/ml。进一步地，所述步骤(1)中3-氨基苯甲酰胺与PARP15蛋白的混合比例为3-氨基苯甲酰胺摩尔数：PARP15蛋白摩尔数＝1:5；所述步骤(1)中3-氨基苯甲酰胺与PARP15蛋白混合后冰上孵育30min。进一步地，所述步骤(2)的过程是：先用晶体枪吸取1μl蛋白质混合物液点到盖玻片上，然后快速按比例取结晶试剂点到蛋白质混合物液滴上，将点好蛋白混合物和结晶试剂的盖玻片反盖到边缘涂有真空脂的盛有1000μl结晶试剂的容器上，压紧，使液滴与容器内的结晶试剂能够在同一个密闭的空间内，3-5天生成复合物结晶。进一步地，所述结晶试剂是0.1MHEPES，质量分数为22％的PEG3350，pH＝6.5的混合物。进一步地，所述PARP15蛋白和3-氨基苯甲酰胺的混合物与结晶试剂混合的体积比例是1:1；所述步骤(2)结晶的温度是20℃。进一步地，所述PARP15蛋白获得步骤包括：构建PARP15蛋白表达质粒；将PARP15蛋白表达质粒转化，诱导培养表达PARP15蛋白；纯化PARP15蛋白。进一步地，所述诱导培养表达PARP15蛋白的操作是：将表达质粒转化到EscherichiacoliBL21Rosetta(DE3)感受态菌株，涂布到含有50μg/mlKan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/mlKan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时后；取100μL菌液到100mL含有50μg/mlKan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/mlKan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间，以IPTG浓度为0.25mmol，200rpm，18℃过夜诱导。进一步地，所述纯化PARP15蛋白的操作是：过夜诱导后以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g；以缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有300mMNaCl，10mM咪唑，100mMTris-HCl，2mMDTT，pH＝7.5的缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱1～2ml，镍柱使用前用20倍柱体积含有300mMNaCl，10mM咪唑，100mMTris-HCl，pH＝7.5的缓冲液对柱子进行平衡，再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、100mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；然后，将300mM咪唑浓度所得的洗脱液用10kDa分子量浓缩管在4℃，凝缩至0.5ml；随后用凝胶层析进行进一步的纯化，凝胶层析柱的型号为：SuperdexTM200Increase10/300GL，凝胶层析的buffer为：300mMNaCl、25mMHEPES、5mMDTT、质量分数为5％的甘油的混合物。收集出峰体积的液体，再使用10kDa分子量浓缩管在4℃对出峰体积的液体进行浓缩，至浓度为5～10mg/ml后，液氮速冻，并储存于-80℃冰箱备用。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：成功获取高纯度的PARP15蛋白，并且首次获得该蛋白与其抑制剂3-AB复合物晶体。对比杆状病毒蛋白表达系统表达PARP15蛋白所需培养基昂贵，并且伴有复杂的生长条件。本专利技术利用大肠杆菌蛋白表达系统获得大量PARP15蛋白，并且周期短，耗费成本低，转化操作简单，并通过特定且操作简便的纯化方法获得高纯度的蛋白产物。3-氨基苯甲酰胺(3-AB)是一种选择性的PARP抑制剂，通过3-AB与PARP15蛋白结合生成晶体，我们可以获得抑制状态下PARP15蛋白复合物结构，通过X射线衍射技术，解析出PARP15蛋白与其抑制剂3-AB复合物的三维结构，解析出抑制状态下PARP15蛋白结构，能够大大地加速关于PARP15蛋白的研究，给予了基于结构的靶向PARP15蛋白药物设计极大的动力，为药物设计、优化提供分子基础。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：图1是蛋白质纯化不同浓度洗脱液SDS-PAGE结果图；图2是凝胶层析柱分子筛结果图；图3是凝胶层析柱分子筛出峰体积液体SDS-PAGE结果图；图4是生成PARP15蛋白与3-氨基苯甲酰胺复合物结晶实验图；图5是PAR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体。/n
【技术特征摘要】
1.PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体。
2.一种如权利要求1所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)把PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺按比例混合；
(2)把(1)所得混合物采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体。
3.根据权利要求2所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述PARP15蛋白的浓度为5～10mg/ml。
4.根据权利要求2所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中3-氨基苯甲酰胺与PARP15蛋白的混合比例为3-氨基苯甲酰胺摩尔数：PARP15蛋白摩尔数＝1:5；
所述步骤(1)中3-氨基苯甲酰胺与PARP15蛋白混合后冰上孵育30min。
5.根据权利要求2所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)的过程是：先用晶体枪吸取1μl蛋白质混合物液点到盖玻片上，然后快速按比例取结晶试剂点到蛋白质混合物液滴上，将点好蛋白混合物和结晶试剂的盖玻片反盖到边缘涂有真空脂的盛有1000μl结晶试剂的容器上，压紧，使液滴与容器内的结晶试剂能够在同一个密闭的空间内，3-5天生成复合物结晶。
6.根据权利要求2所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述结晶试剂是0.1MHEPES，质量分数为22％的PEG3350，pH＝6.5的混合物。
7.根据权利要求2-6任一所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述PARP15蛋白和3-氨基苯甲酰胺的混合物与结晶试剂混合的体积比例是1:1；
所述步骤(2)结晶的温度是20℃。
8.根据权利要求2所述的PARP15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述PARP15蛋白获得步骤包括：构建PARP15蛋白表达质粒；将PARP15蛋白表达质粒转化，诱导培养表达PARP1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李健，张进，周学兰，万双燕，
申请(专利权)人：李健，张进，周学兰，万双燕，
类型：发明
国别省市：上海;31
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