一种氧甲基转移酶突变体及其在生产灵菌红素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氧甲基转移酶突变体及其在生产灵菌红素中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1/S53C

【技术实现步骤摘要】
一种氧甲基转移酶突变体及其在生产灵菌红素中的应用
本专利技术涉及一种氧甲基转移酶突变体及其在生产灵菌红素中的应用，属于生物

技术介绍
灵菌红素是一类含三吡咯骨架结构的天然红色素，主要由一些微生物产生，具有抗癌、免疫抑制、抗虫等多种生物活性，可作为免疫抑制剂和抗癌药物开发，受到研究者的广泛关注。目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。然而，现有的微生物发酵法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Kim等人通过将HahellachejuensisKCTC2396接种至海生菌肉汤2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵40h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28mg/L(具体可见参考文献：KimSJ,LeeHK,LeeYK,etal.MutantselectionofHahellachejuensisKCTC2396andstatisticaloptimizationofmediumcomponentsforprodigiosinyield-up[J].JournalofMicrobiology,2008,46(2):183-188.)；MarthaIngridGutiérrez-Román等人通过将SerratiamarcescensCFFSUR-B4接种至花生基培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达40.6μg/mL(具体可见参考文献：MarthaIngridGutiérrez-Román,FranciscoHolguín-Meléndez,Bello-MendozaR,etal.ProductionofprodigiosinandchitinasesbytropicalSerratiamarcescensstrainswithpotentialtocontrolplantpathogens[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2012,28(1):p.145-153.)。因此，急需找到一种产量高的利用微生物发酵生产灵菌红素的方法以解决现有微生物发酵法存在的缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种产量高的利用微生物发酵生产灵菌红素的方法。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种氧甲基转移酶突变体，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸，命名为S53CPigF；或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸，命名为G176C/M245CPigF；或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸，命名为G176C/M245C/S53CPigF。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述氧甲基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种基因，所述基因编码上述氧甲基转移酶突变体。本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pET-28a质粒。本专利技术还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。本专利技术还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～37℃、转速为180～220rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为200rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、牛肉膏、CaCl2、脯氨酸、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含15～25g/L蔗糖、10～20g/L牛肉膏、5～15g/LCaCl2、5～10g/L脯氨酸、0.1～0.3g/LMgSO4·7H2O和0.04～0.08g/LFeSO4·7H2O。本专利技术还提供了上述氧甲基转移酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述生产灵菌红素的方法在生产灵菌红素中的应用。[有益效果](1)本专利技术提供了比酶活高的氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF，其中，氧甲基转移酶突变体S53CPigF的比酶活高达5.03±0.151U·mg-1，较野生型提高了50.14％；氧甲基转移酶突变体G176C/M245C/S53CPigF的比酶活高达4.95±0.142U·mg-1，较野生型提高了47.76％。(2)本专利技术提供了热稳定性好的氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF，其中，氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF在45℃下孵育20min后的残余酶活分别可达74.2％和76.3％，分别较野生型提高了33.9％和37.7％；氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF在60℃下孵育20min后的残余酶活分别可达26.2％和27.2％，同条件下野生型已失去酶活；氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF在60℃下的半衰期分别可达12.57min和8.31min，分别较野生型提高了1.84倍和1.88倍。(3)本专利技术提供了pH稳定性好的氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF，其中，氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF在pH为4的条件下孵育1h后的残余酶活分别可达24.3％和24.2％，分别较野生型提高了115.0％和114.2％；氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C/S53CPigF在pH为11的条件下孵育1h后的残余酶活分别可达16.4％和16.3％，分别较野生型提高了45.1％和44.2％。(4)本专利技术提供了铜离子耐受性强的氧甲基转移酶突变体S53CPigF和G176C/M245C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧甲基转移酶突变体，其特征在于，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸；/n或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氧甲基转移酶相比，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸；/n或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种氧甲基转移酶突变体，其特征在于，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸；
或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸；
或者，所述氧甲基转移酶突变体与出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的氧甲基转移酶相比，第53位丝氨酸突变为了半胱氨酸，第176位甘氨酸突变为了半胱氨酸，并且，第245位蛋氨酸突变为了半胱氨酸。


2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的氧甲基转移酶突变体。


3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因。


4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2所述的基因或权利要求3的所述重组质粒。


5.如权利要求4所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为粘质沙雷...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，孙杨，杨套伟，徐美娟，张显，邵明龙，付维来，易敢峰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32