酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS制造技术

本申请属于烟草基因工程技术领域，具体涉及GGPPS定向突变蛋白专利申请事宜。现有GGPPS蛋白的154、161和218这三个位点位于酶的催化口袋，209和233这两个位点位于酶分子表面；基于这五个位点，本申请提供了GGPPS系列定向突变蛋白，其中包括：系列单位点突变蛋白、双位点突变蛋白、三位点突变蛋白、四位点突变蛋白、五位点突变蛋白。发明专利技术人利用CAST技术构建“小而精”的突变体文库，通过进一步筛选以及基于定向进化需要，发明专利技术人对特定位点氨基酸突变类型做了详细分析。初步实验结果表明，特定位点氨基酸突变后，β‑胡萝卜素合成量得到了明显提高，为进一步作物新品种培育奠定了一定技术基础。

【技术实现步骤摘要】
酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS
本申请属于烟草基因工程
，具体涉及GGPPS定向突变蛋白专利申请事宜。
技术介绍
类胡萝卜素是一种重要的质体色素，具有重要的生理作用，与植物的生长发育和光合作用密切相关，影响作物品质性状。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)是类胡萝卜素、叶绿素和维生素E的植醇侧链、赤霉素以及二萜植保素的共同前体。GGPP由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPsynthase,GGPPS)催化产生，3分子异戊烯基焦磷酸（IPP）和1分子烯丙基异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，在GGPPS的作用下缩合生成C20的GGPP。GGPP是类胡萝卜素合成的起始底物，能够被类胡萝卜素合成通路的端口酶八氢番茄红素(phytoene)合酶(phytoenesynthase，PSY)催化形成八氢番茄红素，用于合成类胡萝卜素。对植物GGPPS基因家族的大量研究例证表明，该家族成员不仅编码萜类合成通路上游的重要酶蛋白，而且还直接参与调控植物萜类合成的各个通路，在调控方面发挥着核心作用。现有研究中，对于类胡萝卜素合成途径虽然已有较多研究，但从植物改造角度而言，如果能够利用基因工程技术实现定向化的选育和培育，是实现植物最大化利用的重要技术前提。作为合成生物学的关键性技术之一，定向生物进化技术获得了2018年诺贝尔化学奖。该技术广泛用于酶的活性设计，通过定向进化，可有效克服天然酶在环境耐受性、立体/区域选择性、底物特异性、催化效率及产物抑制性等方面存在的缺点，使得自然界成千上万年的进化历程在实验室内较短时间完成。在酶的定向进化技术发展过程中，传统定向进化时，如利用易错PCR、DNA混组、序列饱和突变、随机引发体外重组等技术时，存在突变效率低、筛选工作量大等缺点，制约了酶分子的体外定向进化的应用。组合活性中心饱和突变策略(Combinatorialactive-sitesaturationtest，CAST)则是一种较新的定向进化突变策略，该技术基于蛋白的结构信息，首先借助计算机的模拟基础，随后在酶催化活性中心周围选取与底物有直接相互作用的氨基酸残基，通过构建“小而精”的突变体文库，从而减少突变体文库的筛选规模。总体上，虽然定向进化技术可以加快作物基因的进化历程，为作物品质的改良提供优质基因，但由于发展时间较短，且存在其他技术难题，因此目前定向进化技术仍未用于植物基因的改造。烟草作为基因工程研究的模式作物之一，同时烟草内类胡萝卜素含量直接影响了烟草的品质性状。因此，如能结合定向进化对烟草萜类合成基因进行定向改造，对于加快烟草育种具有十分重要的应用意义，同时也可为其他作物的遗传育种奠定一定技术基础。
技术实现思路
通过对牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPsynthase，GGPPS)酶结构研究，结合定向进化技术，本申请目的在于提供若干具有更好酶活的GGPPS及烟草GGPPS基因，从而为烟草育种、烟草新品种培育提供一种新的技术思路，同时也为其他作物育种和品种改良奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。在对现有GGPPS结构研究过程中，专利技术人认为现有GGPPS蛋白（对应基因序列为，GenBank登录号NM_001325177.1）的第154位、第161位和第218位这三个位点位于酶的催化口袋，因此对这三个位点氨基酸进行定向突变后，有利于底物与酶活口袋的结合，从而有利于提高GGPPS的酶活性能；而第209位和第233位这两个位点位于酶分子表面，对这两个位点的氨基酸进行定向突变后，有利于形成GGPPS同源二聚体，从而增强蛋白的稳定性；基于上述五个位点，本申请中，专利技术人提供了GGPPS系列定向突变蛋白，其中包括：系列单位点突变蛋白、系列双位点突变蛋白、系列三位点突变蛋白、系列四位点突变蛋白、系列五位点突变蛋白，具体介绍说明如下。单位点突变中：GGPPS定向单点突变蛋白GGPPS-154，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第154位的Val（V）氨基酸突变为中性氨基酸Ala（A）或者突变为半胱氨酸Cys（C）；GGPPS定向单点突变蛋白GGPPS-161，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第161位的Ile（I）氨基酸突变为中性脂肪族氨基酸Leu（L）或者突变为含有巯基的氨基酸Met（M）；GGPPS定向单点突变蛋白GGPPS-209，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第209位Ile（I）氨基酸突变为碱性氨基酸Lys（K）、含有羟基的氨基酸Ser（S），或者突变为天冬氨酸Asp（D）、天冬酰胺Asn（N）、丙氨酸Ala（A）或脯氨酸Pro（P）中任一个；GGPPS定向单点突变蛋白GGPPS-218，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第218位Phe（F）氨基酸突变为芳香族氨基酸酪氨酸Tyr（Y）或者突变为亮氨酸Leu（L）；GGPPS定向单点突变蛋白GGPPS-233，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第233位氨基酸Val突变为酸性氨基酸酸为Glu（E）或者突变为酪氨酸Tyr（Y）；所述现有烟草GGPPS蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。双位点突变中：在上述单位突变基础上，任意两两单位点组合所构成的突变蛋白，均表现出更好酶活效果，具体而言，所述双位点突变蛋白例如为：GGPPS定向双位点突变蛋白209-233，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第209位的Ile氨基酸和第233位氨基酸Val同时发生突变；第209位Ile（I）氨基酸突变为碱性氨基酸Lys（K）、含有羟基的氨基酸Ser（S）、天冬氨酸Asp（D）、天冬酰胺Asn（N）、丙氨酸Ala（A）或脯氨酸Pro（P）中任一个，第233位氨基酸Val突变为酸性氨基酸酸为Glu（E）或者突变为酪氨酸Tyr（Y）；也即，所述GGPPS定向双位点突变蛋白209-233在209和233位点组合为：209K-233E、209S-233E、209P-233E、209S-233Y或者209P-233Y等。三位点突变中：在上述单位突变基础上，任意三位点组合所构成的突变蛋白，均表现出更好酶活效果，具体而言，所述双位点突变蛋白例如为：定向三点突变蛋白GGPPS-154-161-218，与现有烟草GGPPS蛋白相比，其第154位的Val氨基酸、第161位的Ile氨基酸和第218位Phe氨基酸同时发生突变；第154位的Val（V）氨基酸突变为中性氨基酸Ala（A）或者突变为半胱氨酸Cys（C）；第161位的Ile（I）氨基酸突变为中性脂肪族氨基酸Leu（L）或者突变为含有巯基的氨基酸Met（M）；第218位Phe（F）氨基酸突变为芳香族氨基酸酪氨酸Tyr（Y）或者突变为亮氨酸Leu（L）；也即，所述GGPPS定向三点突变蛋白GGPPS-154-161-218组合为：154A-161M-218L、154A-161M-218Y、154A-161L-218L、154A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS，其特征在于，与现有烟草GGPPS蛋白相比，第154位的Val氨基酸、第161位的Ile氨基酸、第209位Ile氨基酸、第218位Phe氨基酸和第233位氨基酸Val同时发生突变；/n第154位的Val氨基酸突变为中性氨基酸Ala或者突变为半胱氨酸Cys；/n第161位的Ile氨基酸突变为中性脂肪族氨基酸Leu或者突变为含有巯基的氨基酸Met；/n第209位Ile氨基酸突变为碱性氨基酸Lys、含有羟基的氨基酸Ser、天冬氨酸Asp、天冬酰胺Asn、丙氨酸Ala、或脯氨酸Pro；/n第218位Phe氨基酸突变为芳香族氨基酸酪氨酸Tyr或者突变为亮氨酸Leu；/n第233位氨基酸Val突变为酸性氨基酸酸为Glu或者突变为酪氨酸Tyr；/n所述现有烟草GGPPS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS，其特征在于，与现有烟草GGPPS蛋白相比，第154位的Val氨基酸、第161位的Ile氨基酸、第209位Ile氨基酸、第218位Phe氨基酸和第233位氨基酸Val同时发生突变；
第154位的Val氨基酸突变为中性氨基酸Ala或者突变为半胱氨酸Cys；
第161位的Ile氨基酸突变为中性脂肪族氨基酸Leu或者突变为含有巯基的氨基酸Met；
第209位Ile氨基酸突变为碱性氨基酸Lys、含有羟基的氨基酸Ser、天冬氨酸Asp、天冬酰胺Asn、丙氨酸Ala、或脯氨酸Pro；
第218位Phe氨基酸突变为芳香族氨基酸酪氨酸Tyr或者突变为亮氨酸Leu；
第233位氨基酸Val突变为酸性氨基酸酸为Glu或者突变为酪氨酸Tyr；
所述现有烟草GGPPS蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS，其特征在于，所述五位点突变蛋白GGPPS组合为：154A-161M-209K-218Y-233E、154A-161M-209S-218Y-233E、154A-161L-209S-218Y-23...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燃，董臣，李锋，魏攀，金立锋，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41