一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途，本发明专利技术从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离到的淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列构建至pET‑30a载体，转化BL21感受态细胞，从转化后的单个菌落中筛选得到一个针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH‑VL

【技术实现步骤摘要】
一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体。此外，本专利技术还涉及到该抗体的制备方法和用途。本专利技术属于生物

技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanswinefeverVirus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起着至关重要的作用。抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。1988年，Bird和Huston等第一次将单链抗体研制出来，在此后的三十年里，科研人员对单链抗体的研究一直没有间断，不仅研制出了单链抗体多聚体、双特异性单链抗体等多种抗体形式，还建立了单链抗体的多种展示系统。单链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗体具有很好的穿透性,易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。回顾近些年来抗体领域的发展情况，我们可以看出，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其由SEQIDNO.1所述的序列编码。其中，优选的，所述的单链抗体由SEQIDNO.1所述的序列通过原核表达系统表达、纯化后获得。进一步，本专利技术还提出了一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)的制备方法，包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；(2)淋巴细胞总mRNA的提取提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；(3)全基因cDNA合成以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；(4)第一轮扩增以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；98℃2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集300bp产物，-20℃保存备用；P1:5-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3R1:5-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3F1:5-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3B11:5-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3B12:5-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3B13:5-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3(5)第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、56℃5s、72℃30s、35个循环，72℃10min；98℃2min，98℃10s、68℃30s、30个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集320bp产物，置-20℃保存备用；R2:5-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3F2:5-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3(6)第三轮扩增以第二轮扩增产物为模板，以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，扩增程序为：①无引物：98℃2min，98℃10s、68℃30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃2min，98℃10s、55℃5s、72℃50s、35个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集800bp产物，置-20℃保存备用。(7)T-A克隆鉴定I将第三轮扩增产物进行3’端加“A”处理，反应程序为65℃10min；II将加A产物连接至PMDTM20-T载体上，连接程序为16℃30min；III将连接产物转化至E.coliJM109感受态中，100μL感受态细胞转化10μL连接产物，将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8-16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，送测序，筛选出基因序列正确的质粒；(8)ScFv抗体的构建与制备准备BL21感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL由测序正确的扩增产物构建的ScFv-PET-30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8-16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟病毒的单链抗体。其中，优选的，所述的淋巴细胞分离是按照以下步骤进行：(1)自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中加入等量的全血稀释液，混匀，得到全血的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其特征在于，所述的单链抗体由SEQ IDNO.1所述的序列编码。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其特征在于，所述的单链抗体由SEQIDNO.1所述的序列编码。


2.如权利要求1所述的单链抗体(ScFv)，其特征在于，所述的单链抗体由SEQIDNO.1所述的序列通过原核表达系统表达、纯化后获得。


3.一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)淋巴细胞分离
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
(2)淋巴细胞总mRNA的提取
提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
(3)全基因cDNA合成
以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
(4)第一轮扩增
以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；98℃2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集300bp产物，-20℃保存备用；
P1:5-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3
R1:5-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3
F1:5-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3
B11:5-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3
B12:5-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3
B13:5-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3
(5)第二轮扩增
以第一轮扩增产物为模板，以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、56℃5s、72℃30s、35个循环，72℃10min；98℃2min，98℃10s、68℃30s、30个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集320bp产物，置-20℃保存备用；
R2:
5-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3F2:5-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3
(6)第三轮扩增
以第二轮扩增产物为模板，以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，扩增程序为：①无引物：98℃2min，98℃10s、68℃30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃2min，98℃10s、55℃5s、72℃50s、35个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集800bp产物，置-20℃保存备用。
(7)T-A克隆鉴定
I将第三轮扩增产物进行3’端加“A”处理，反应程序为65℃10min；
II将加A产物连接至PMDTM20-T载体上，连接程序为16℃30min；
III将连接产物转化至E.coliJM109感受态中，100μL感受态细胞转化10μL连接产物，将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8-16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，送测序，筛选出基因序列正确的质粒；
(8)ScFv抗体的构建与制备
准备BL21感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL由测序正确的扩增产物构建的ScFv-PET-30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8-16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟病毒的单链抗体。

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，王丽娟，田宏，石正旺，罗俊聪，杨帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62