一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019330杂交瘤细胞分泌，杂交瘤细胞以GST‑ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成；本发明专利技术成功克隆了PGEX‑4T‑3‑ORF121重组质粒，筛选出一株抗Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的细胞株CyHV‑2‑ORF121‑3D9，首次获得了抗CyHV‑2‑ORF121的单克隆抗体，可特异性识纯化的CyHV‑2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV‑2的异育银鲫尾鳍细胞系，可用于制备关于CyHV‑2检测试纸条或试剂盒的应用。

【技术实现步骤摘要】
一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
鲫鱼(Cruciancarp)在我国淡水养殖业的养殖规模越来越大，据2018年中国渔业统计年鉴显示，我国的鲫鱼年产量为277.2万吨，其中主要养殖品种为异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)。近几年，由于疱疹病毒性造血器官坏死病(Herpesviralhaematopoieticnecrosis,HVHN)的爆发，给国内外异育银鲫养殖产业带来了巨大的经济损失，该病的主要病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2)。目前针对CyHV-2比较成熟的检测方法包括电镜诊断技术、PCR扩增技术[1]、细胞培养分离鉴定和环介导等温扩增技术[2]等，但是基于免疫学的检测方法研究相对较少，其中，有研究利用CyHV-2壳蛋白ORF72[3]，ORF92[4]为抗原制备了单克隆抗体，可以有效检测感染CyHV-2的组织及细胞，首次建立了CyHV-2的免疫学检测方法。参考文献:[1]GoodwinAE,MerryGE,SadlerJ.Detectionoftheherpesviralhematopoieticnecrosisdiseaseagent(Cyprinidherpesvirus2)inmoribundandhealthygoldfish:validationofaquantitativePCRdiagnosticmethod[J].DiseasesofAquaticOrganisms,2006,69(2-3):137-143.[2]HeJQ,ShiXJ,YuL,etal.Developmentandevaluationofaloop-mediatedisothermalamplificationassayfordiagnosisofCyprinidherpesvirus2[J].Journalofvirologicalmethods,2013,194(1-2):206-210.[3]KongSY,JisngYS,WangQ,etal.DetectionmethodsofCyprinidherpesvirus2infectioninsilvercruciancarp(Carassiusauratusgibelio)viaapORF72monoclonalantibody[J].JournalofFishDiseases,2017,40(12):1791-1798.[4]ShenZY,JiangYS,LuJF,etal.ApplicationofamonoclonalantibodyspecificfortheORF92capsidproteinofCyprinidherpesvirus2[J].JournalofVirologicalMethods,2018,261:22-27。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术的首要目的是提供一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体。因此，本专利技术制备的CyHV-2-ORF121单克隆抗体3D9细胞株可以为开发CyHV-2免疫学检测方法提供更多的理论依据。本专利技术的第二个目的是提供上述单克隆抗体的应用。本专利技术的第三个目的是提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞。为达到上述首要目的，本专利技术的解决方案是：一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2019330的杂交瘤细胞分泌，单克隆抗体特异性识别纯化的CyHV-2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV-2的GiCF细胞。优选地，杂交瘤细胞的制备方法为：以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。优选地，GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫小鼠脾脏细胞的获得方法为：第一次免疫为抗原与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后对小鼠腹腔注射免疫；14天后进行第二次免疫，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分乳化后腹腔注射小鼠进行免疫；7天后第三次免疫采用不加佐剂的抗原腹腔注射免疫；7天后进行第四次免疫，不加佐剂的抗原腹腔注射。优选地，GST-ORF121重组蛋白的制备方法为：从Ⅱ型鲤疱疹病毒PCR扩增出ORF121基因，将ORF121基因克隆至PGEX-4T-3质粒上，获得重组质粒PGEX-4T-3-ORF121；将重组质粒PGEX-4T-3-ORF121转染到大肠杆菌中诱导表达出GST-ORF121重组蛋白。为达到上述第二个目的，本专利技术的解决方案是：一种上述的单克隆抗体特异性识别纯化的CyHV-2病毒颗粒和ORF121重组蛋白，其在制备Ⅱ型鲤疱疹病毒检测试纸条或试剂盒中应用。为达到上述第三个目的，本专利技术的解决方案是：一株分泌Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞的保藏号为CCTCCNO:C2019330。优选地，杂交瘤细胞的制备方法为：以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术成功克隆了PGEX-4T-3-ORF121重组质粒，筛选出一株抗Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的细胞株CyHV-2-ORF121-3D9，首次获得了抗CyHV-2-ORF121的单克隆抗体，可特异性识别纯化的CyHV-2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV-2的GiCF细胞，可用于制备关于CyHV-2检测试纸条或试剂盒的应用。附图说明图1为Dot-Blot法筛选阳性最强的细胞株结果图。图2为Western-blo验证阳性细胞株结果图。图3为免疫荧光检测感染CyHV-2的GiCF细胞图。Ⅱ型鲤疱疹病毒(CyHV-2)ORF1213D9杂交瘤细胞株在2019年12月12日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCCNO:C2019330。具体实施方式本专利技术提供了一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用。以下结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1：多克隆抗体制备：本专利技术中采用的重组质粒在上海海洋大学病原库本实验室内保存，感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶、T4连接酶均购自TaKaRa公司(即宝生物工程(大连)有限公司)。ORF121原核表达1.1ORF121基因片段扩增根据CyHV-2ORF121的基因序列设计特异性引物(F:5′-CCGGAATTCCATGTCTACAGAAATGGTTTTCATCG-3′(SEQIDNO.1)；R:5′-CCGCTCGAGTCCTACATATCGTCTTCATCCTCGGGT-3′(SEQIDNO.2))本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019330的杂交瘤细胞分泌。/n

【技术特征摘要】
1.一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2019330的杂交瘤细胞分泌。


2.根据权利要求1所述的一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述杂交瘤细胞的制备方法为：以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。


3.根据权利要求2所述的一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫小鼠脾脏细胞的获得方法为：第一次免疫为抗原与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后对小鼠腹腔注射免疫；14天后进行第二次免疫，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分乳化后腹腔注射小鼠进行免疫；7天后第三次免疫采用不加佐剂的抗原腹腔注射免疫；7天后进行第四次免疫，不加佐剂的抗原腹腔注射。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜有声，高娃，王浩，吕利群，郑义华，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31