一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术首次公开了一种EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、GAS、SEQ ID NO.5所示。该抗体能够阻断EBV感染上皮细胞，IC50为53ng/ml，而对埃博拉病毒感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染上皮细胞的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及抗体
，更具体地，涉及一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
EB病毒最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例,美国NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的人源单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的人源单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。
技术实现思路
本专利技术第一个方面的目的，在于利用EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)膜蛋白gH/gL(glycoproteinH,glycoproteinL)作为钓饵，筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(singlechainvariablefragment,scFvs)文库，得到可同gH/gL蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有高中和活性的单克隆抗体。本专利技术第二个方面的目的，在于提供编码本专利技术第一个方面所述抗体的核苷酸序列。本专利技术第三个方面的目的，在于提供含有本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列的转基因细胞系。本专利技术第四个方面的目的，在于提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本专利技术第一个方面所述的抗体。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为GFSFDTYD(SEQIDNO.1)，CDR2的氨基酸序列为ISYDGSET(SEQIDNO.2)，CDR3的氨基酸序列为ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQIDNO.3)；所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为QSISGTY(SEQIDNO.4)，CDR2’的氨基酸序列为GAS，CDR3’的氨基酸序列为QQYGSSLFT(SEQIDNO.5)。根据本专利技术第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。根据本专利技术第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。根据本专利技术第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。根据本专利技术第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示。本专利技术的第二个方面，提供一种编码本专利技术第一个方面所述抗体的核苷酸序列。根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列如下所示：CDR1的核苷酸序列为：GGATTTTCCTTCGATACCTATGAC(SEQIDNO.6)；CDR2的核苷酸序列为：ATTTCATATGATGGAAGTGAGACA(SEQIDNO.7)；CDR3的核苷酸序列为：GCGAGATGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGCGGAGTTCATGGACGTC(SEQIDNO.8)；根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列如下所示所示。CDR1’的核苷酸序列为：CAGAGTATTAGCGGCACCTAC(SEQIDNO.9)；CDR2’的核苷酸序列为：GGTGCATCCC；CDR3’的核苷酸序列为：CAGCAGTATGGTAGCTCACTATTCACT(SEQIDNO.10)。根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。根据本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。本专利技术的第三个方面，提供含有本专利技术第二个方面所述核苷酸序列的转基因细胞系。本专利技术的第四个方面，提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本专利技术第一个方面所述的抗体。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次公开了一种中和EB病毒的抗体，通过酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(singlechainvariablefragment,scFvs)文库中分离特异性结合抗原的酵母单克隆，然后进行单克隆抗体基因的克隆和结构功能研究以及筛选。既避免了由于抗原免疫、杂交瘤融合和单克隆抗体筛选所需要的漫长过程，也可以大大降低动物来源抗体所引起的副作用。本专利技术采用该方法，利用gH/gL筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段文库，获得可以特异性结合抗原的酵母单克隆，获得抗体可变区基因，然后将抗体可变区基因克隆到含有对应恒定区的真核细胞表达载体上并转染293T细胞，即可得到同gH/gL蛋白特异结合的单克隆抗体。然后通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有抗EBV中和活性的单克隆抗体。本专利技术提供的该中和EB病毒的抗体能够阻断EBV感染上皮细胞，IC50为53ng/ml，而对埃博拉病毒的感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染上皮细胞的能力。附图说明图1实施例3中M3抗体对EBV感染HNE1细胞的中和效果。图2实施例3中M3抗体对埃博拉假病毒感染Huh7细胞的中和效果。具体实施方式(1)EBVgH/gL重组蛋白的制备。将编码EBVgH/gL蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，/n其中，CDR1的氨基酸序列为GFSFDTYD(SEQ ID NO.1)，/nCDR2的氨基酸序列为ISYDGSET(SEQ ID NO.2)，/nCDR3的氨基酸序列为ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQ ID NO.3)；/n所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，/n其中，CDR1’的氨基酸序列为QSISGTY(SEQ ID NO.4)，/nCDR2’的氨基酸序列为GAS，/nCDR3’的氨基酸序列为QQYGSSLFT(SEQ ID NO.5)。/n

【技术特征摘要】
1.一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，
其中，CDR1的氨基酸序列为GFSFDTYD(SEQIDNO.1)，
CDR2的氨基酸序列为ISYDGSET(SEQIDNO.2)，
CDR3的氨基酸序列为ARWEIVVVPAAAEFMDV(SEQIDNO.3)；
所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，
其中，CDR1’的氨基酸序列为QSISGTY(SEQIDNO.4)，
CDR2’的氨基酸序列为GAS，
CDR3’的氨基酸序列为QQYGSSLFT(SEQIDNO.5)。


2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。


3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。


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【专利技术属性】
技术研发人员：曾木圣，张林琦，朱倩莹，梁清泰，左亚男，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，清华大学，
类型：发明
国别省市：广东;44