抗HPV16E7蛋白单抗79A11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗HPV16E7蛋白单抗79A11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用，该杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201718，该杂交瘤细胞能够分泌效价高的单克隆抗体，获得抗体能够与HPV16阳性的细胞株CaSki和HPV16阳性宫颈癌鳞癌石蜡组织切片反应，具有很好的特异性；可以作为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、化学发光试剂盒、Western blot的检测试剂盒、免疫层析试纸、电化学试剂盒或磁珠试剂盒等。

Anti HPV16E7 monoclonal antibody 79a11, hybridoma cell line and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗HPV16E7蛋白单抗79A11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及抗HPV16E7蛋白单抗79A11，还涉及杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。
技术介绍
宫颈癌是全球妇女癌症中居第四位的癌症，每年新增530，000病例和死亡275，000例，这些病例中大约85％来源于发展中国家。在中国，宫颈癌发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(Highriskhumanpapillomavirus，HR-HPV)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的直接病因，其中HPV16型最高，占53％。HPVE7蛋白是HPV致癌的关键分子，E7致癌蛋白选择性表达在肿瘤细胞中，不在正常细胞中表达，随着宫颈上皮内瘤CIN变从低级别向高级别(从CIN1经历CIN2、CIN3到侵蚀性宫颈癌)进展，E7致癌蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高，最终致癌蛋白E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。HR-HPV检测联合细胞学检查(如TCT)，可以增加宫颈上皮内瘤变(CIN)III的检出率并减少宫颈癌的发生，共同检测方法也可增加宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。对30～65岁女性进行细胞学和HPVDNA共同检测，不可避免会出现少部分细胞学检查结果阴性但HR—HPVDNA检测阳性者。美国最新的宫颈癌筛查指南提供了2种方案：(1)在12个月时重复细胞学和HR—HPV共同检测。如果重复共同检测时HPV阳性或细胞学检查结果为LSIL或更严重者，则应行阴道镜检查；(2)立即行HPV基因分型检测(HPVl6或HPVl8)。新的筛查指南对HR—HPV检测结果阳性者缺乏肯定、一致的处理方案，而且阴道镜检查是有创伤的检查，也增加患者心理负担和经济负担。因此，针对那些细胞学检查结果阴性但HR-HPV的DNA检测阳性的妇女，因为HR-HPV的DNA检测阳性不能预测哪些患者最终发展为宫颈内瘤变CIN1、CIN2、CIN3和宫颈浸润癌，但如果补充检测HR-HPV的E7致癌蛋白比如HPV16E7、HPV18E7致癌蛋白等，就可以间接提示宫颈有癌细胞的存在，很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在，最终达到早期预警、早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗HPV16E7蛋白单抗79A11；本专利技术的目的之二在于提供分泌抗HPV16E7蛋白单抗79A11的杂交瘤细胞HPV16E7-79A11；本专利技术的目的之三在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11的制备方法；本专利技术的目的之四在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11制备检测HPV16E7的试剂盒中的应用；本专利技术的目的之五在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11作为捕获抗体中的应用；本专利技术的目的之六在于提供含有所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11的试剂盒。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、抗HPV16E7蛋白单抗79A11，所述单抗79A11包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.6的第50-54位、第69～87位、第120-126位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQIDNO.8的第44～59位、第75～81位和第114-122位所示。优选的，单抗重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。优选的，单抗重链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；单抗轻链核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。优选的，所述单抗79A11由杂交瘤细胞HPV16E7-79A11分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C201718。2、分泌抗HPV16E7蛋白单抗79A11的杂交瘤细胞HPV16E7-79A11，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C201718。3、所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11的制备方法，包括如下步骤：以HPV16E7蛋白为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术将SP2/0与免疫BALB/c小鼠的脾细胞或淋巴结细胞融合，筛选稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白的杂交瘤细胞株，制备单抗腹水，经纯化获得抗HPV16E7蛋白单抗79A11。4、所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用。5、所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11作为捕获抗体中的应用。6、含有所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11的试剂。优选的，所述试剂为所述试剂为ELISA试剂、免疫化学试剂、免疫荧光试剂、化学发光免疫分析试剂、Westernblot检测试剂、免疫层析试纸的试剂、电化学试剂或磁珠试剂。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了分泌抗HPV16E7蛋白单抗79A11的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能够分泌抗HPV16E7蛋白单抗79A11，可以用于HPV16E7蛋白的定量检测，并且具有特异性好、灵敏度高的优点，可以用于制备检测宫颈癌的试剂盒，如ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒或Westernblot检测试剂盒，对宫颈癌早期诊断具有重要意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为Westernblot检测纯化HPV16E7蛋白与组氨酸标签抗体反应结果。图2为纯化后的单抗79A11的10％SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1和2道发现在分子量68kDa和25kDa处分别出现两条带)。图3为间接ELISA测定单抗79A11的最高效价图。图4为4对可以配对单抗的单抗。图5为单抗79A11与CaSki细胞和HeLa细胞的免疫细胞化学结果图(10×20)。图6为单抗79A11与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌、HPV18阳性的宫颈癌腺癌的免疫组织化学结果图。图7单抗79A11的亲和力测定图。图8为单抗配对及定量检测HPV16E7蛋白的双抗夹心ELISA法的建立(A：为捕获抗体浓度优化图；B：抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应时间优化图；C：双抗夹心ELISA检测的抗原HPV16E7蛋白含量与OD450nm之间的线性关系图；D：为计算抗原的检测限的回归方程图；E：抗原与信噪比值的关系图)。图9为基于BAS-鲁米诺-双抗夹心ELISA法的捕获抗体浓度、抗原在ng级和μg级的线性关系图(A：捕获抗体79A11最佳浓度优化图；B：生物素化检测抗体Biotin-69E2浓度优化图；C：抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体作用时间优化图；D：3个封闭剂的3个时间点的本底图，E：3个封闭剂的3个时间点的信号图；F、G、H依次为抗原HPV16E7蛋白在ng级等比等差稀释法的直线拟合、双对数拟合和信噪比图；.I、J、K依次为抗原HPV16E7蛋白在μg级等比等差稀释法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗HPV16E7蛋白单抗79A11，其特征在于：所述单抗79A11包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6的第50-54位、第69～87位、第120-126位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.8的第44～59位、第75～81位和第114-120位所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗HPV16E7蛋白单抗79A11，其特征在于：所述单抗79A11包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.6的第50-54位、第69～87位、第120-126位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQIDNO.8的第44～59位、第75～81位和第114-120位所示。


2.根据权利要求1所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11，其特征在于：单抗重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


3.根据权利要求2所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11，其特征在于：单抗重链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；单抗轻链核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


4.根据权利要求1所述抗HPV16E7蛋白单抗79A11，其特征在于：所述单抗79A11由杂交瘤细胞HPV16E7-79A11分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C201718。


5.分泌抗HPV16E7蛋白单抗79A11的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡仁建，杨丽群，
申请(专利权)人：重庆理工大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50