编码基因、载体、抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种编码基因、载体、抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用，该抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。该抗独特型纳米抗体是通过噬菌体展示技术成功筛选到所需抗独特型纳米抗体的编码基因，接着，将该编码基因连接到毕赤酵母表达载体中，并电转化至毕赤酵母感受态细胞培养制得的。该抗独特型纳米抗体能够特异性地阻断单抗1E7与PCV2 Cap蛋白的结合，具有模拟PCV2 Cap关键抗原表位的作用，其可用于开发防治PCV2的抗独特性纳米抗体疫苗、诊断试剂及生物试剂等。

【技术实现步骤摘要】
编码基因、载体、抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种编码基因、载体、抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)分为非致病性的PCV1(Porcinecircovirustype1，PCV1)和致病性的PCV2(Porcinecircovirustype2，PCV2)两种类型。PCV2的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的发生密切相关，其ORF2编码病毒的衣壳蛋白(Capsidprotein，Cap)是诱导宿主免疫的主要免疫原性蛋白，包含病毒主要的抗原表位。现有技术中，“镜影像”抗独特型抗体(Ab2β)在结构或功能上模拟抗原，可用于制备抗独特型抗体疫苗，识别并鉴定PCV2的细胞受体，用于PCV2诊断方法的建立。目前，抗独特型抗体的制备方法主要包括多克隆抗体技术、单克隆抗体技术和抗体库技术。多克隆抗体技术制备抗独特型抗体具有批次间抗体质量不均一、纯化工作繁琐等缺点。单克隆抗体技术存在着生产成本高、生产周期长、制备复杂和储存费用高等不足。而抗体库噬菌体展示技术具有简便、快速、经济等特点。另外，纳米抗体是只由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，是已知的最小的具有完整抗原结合功能的抗体片段，其相对分子质量仅为抗体的1/10。与普通抗体相比较其特异性更高、亲和力以及结合抗原的能力更强，纳米抗体还具有较强的组织穿透力、高耐热性和高稳定性、高水溶性及易于表达的优点。因此，目前亟待寻找一种制备模拟PCV2Cap蛋白关键抗原表位的抗独特型纳米抗体的方法。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种抗独特型纳米抗体，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种抗独特型纳米抗体，用于模拟PCV2Cap蛋白的抗原表位；所述PCV2Cap蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；所述抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述的抗独特型纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种载体，其包含上述的编码基因。作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述载体是通过将所述编码基因酶切后，再连接到毕赤酵母表达载体中得到的。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述毕赤酵母表达载体为pPICZαA载体。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种抗独特型纳米抗体的制备方法，其包括以下步骤：将上述的载体电转化入到酵母感受态细胞中，并经活化后，再涂布于培养基上进行培养，得到单克隆菌落；挑取所述单克隆菌落，并利用甲醇进行诱导表达，得到所述抗独特型纳米抗体。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述酵母感受态细胞为X-33毕赤酵母感受态细胞。作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述培养基为博来霉素抗性的培养基。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述的抗独特型纳米抗体在制备防治PCV2疫苗和/或检测试剂中的应用。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述的抗独特型纳米抗体在制备抗PCV2抗体中的应用，所述抗PCV2抗体特异性地与所述抗独特型纳米抗体结合。本专利技术实施例提供的一种抗独特型纳米抗体，是通过噬菌体展示技术成功筛选到所需抗独特型纳米抗体的编码基因，接着，将该编码基因连接到毕赤酵母表达载体中，并电转化至毕赤酵母感受态细胞，培养制得的。该抗独特型纳米抗体能够特异性地阻断单抗1E7与PCV2Cap蛋白的结合，具有模拟PCV2Cap关键抗原表位的作用，其可用于开发防治PCV2的抗独特性纳米抗体疫苗、诊断试剂及生物试剂等。附图说明图1为单克隆抗体1E7结合PCV2Cap多肽的ELISA检测结果图。图2为单克隆抗体1E7结合抗独特型纳米抗体多肽的ELISA检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1该实施例提供了一种抗独特型纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。具体的，该编码基因的筛选方法包括以下步骤：S1、将2mg市售的单克隆抗体1E7与等体积弗氏佐剂乳化免疫双峰驼，免疫前采血进行血清抗体效价检测。S2、使用含抗凝剂采血袋采集免疫后双峰驼外周血液250mL并分离淋巴细胞。S3、提取淋巴细胞总RNA并反转录合成cDNA，巢式PCR扩增VHH基因。S4、构建VHH-pCANTAB5E重组噬菌体表达载体并电转化至TG1感受态细胞，成功构建了库容量7×109的噬菌体文库。S5、通过噬菌体展示技术从上述噬菌体文库中成功筛选到一株抗独特型纳米抗体，并测定其DNA序列和氨基酸序列，分别如序列表中的SEQIDNO:3和SEQIDNO:2所示。实施例2该实施例提供了一种抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。该抗独特型纳米抗体的制备方法包括以下步骤：S1、将上述实施例1提供的编码基因进行酶切后，再连接到毕赤酵母表达载体中进行重组，得到含有上述编码基因的载体，记为pPICZαA-VHH载体；其中，毕赤酵母表达载体可以采用现有市售的pPICZαA载体。S2、将上述pPICZαA-VHH载体经限制酶SacI单酶切线性化后，再电转入到X-33毕赤酵母感受态细胞中进行活化处理；接着，将活化处理后的X-33毕赤酵母感受态细胞涂布于含有100μg/mL博来霉素的YPD/琼脂平板上进行培养，得到单克隆菌落。S3、对上述单克隆菌落进行PCR鉴定，接着，选取阳性单克隆菌落转接至BMGY培养基中，并置于30℃、210rpm的条件下进行培养24h后，再转接至BMMY培养基中，并用0.5％的甲醇作为诱导剂，每天加一次甲醇，以及置于30℃210rpm的条件下进行诱导至第五天后，再经12000g的离心力进行离心5min，收取上清液；然后，用1MTris-base溶液调节上述上清液的pH至8.0，并使用0.45μm滤膜过滤上清液，最后将上清液经Ni柱(购于Roche公司)纯化，即可获得高纯度的抗独特性纳米抗体。实施例3该实施例提供了一种抗独特型纳米抗体，其氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。该抗独特型纳米抗体的制备方法包括以下步骤：S1、将上述实施例1提供的编码基因进行酶切后，再连接到毕赤酵母表达载体中进行重组，得到含有上述编码基因的载体，记为pPICZαA-VHH载体；其中，毕赤酵母表达载体可以采用现有市售的pPICZαA载体。S2、将上述pPICZαA-VHH载体经限制酶SacI单酶切线性化后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗独特型纳米抗体，其特征在于，所述抗独特型纳米抗体用于模拟PCV2 Cap蛋白的抗原表位；所述PCV2 Cap蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗独特型纳米抗体，其特征在于，所述抗独特型纳米抗体用于模拟PCV2Cap蛋白的抗原表位；所述PCV2Cap蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；所述抗独特型纳米抗体的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。


2.一种如权利要求1所述的抗独特型纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。


3.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求2所述的编码基因。


4.根据权利要求3所述的一种载体，其特征在于，所述载体是通过将所述编码基因酶切后，再连接到毕赤酵母表达载体中得到的。


5.根据权利要求4所述的一种载体，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pPICZαA载体。


6.一种抗独特型纳米抗体的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：周恩民，张桂夕，张璐，蔡雪辉，涂亚斌，王刚，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：陕西;61