一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)制造技术

本发明专利技术公开了一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)

An anti smallpox immunoglobulin f (AB \u2032)

【技术实现步骤摘要】
一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
本专利技术涉及生物技术制药领域，具体涉及一种抗天花病毒的免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法。
技术介绍
天花(Smallpox)是一种由天花病毒(ViriolaVirus)引起的烈性传染病。天花是世界上传染性最强的疾病之一。天花病毒不仅繁殖快，能在空气中迅速传播，而且在感染后的15-20天内致死率高达30％。猴痘是一种病毒性人兽共患病，人类中出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似，属于天花类疾病。痘苗病毒天坛株是自1926年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒经连续传代减毒而获得，自1980年WHO宣布全球消灭天花后，疫苗停止使用。至今，猴痘仍然在非洲部分地区散发。由于各国相继停止接种牛痘疫苗，目前人类已失去针对天花和猴痘的免疫力。尽管美国、中国已研发了化学治疗药物西多福韦，但针对病毒的靶点不同，并且不是天花和猴痘的特异性治疗药品，会造成很严重的肝脏和肾脏损伤，久用可能造成广泛的病毒耐药性问题。除通过疫苗接种进行预防以外，目前对于天花类疾病临床上尚无有效的生物治疗药物。根据人类历史与传染病斗争的经验，最有效而经济的手段之一是抗血清的被动免疫精准治疗，在某些重要传染病的治疗和预防上至今仍被使用，发挥着重要的作用。传统马抗血清的优点是：(1)制备工艺成熟、简单，便于大规模生产，在应急治疗效果上是绝对有效的；(2)抗体经胃酶切割，保留了F(ab′)2功能集团，能去掉大部分引起副反应的IgG全分子和Fc片段，稳定性较高，亲和力强；(3)马血清对人的异源性要比其它动物弱等优点；传统马抗血清缺点是：免疫球蛋白F(ab′)2片段纯度低(2015年中国药典的质量标准是F(ab′)2片段占总蛋白不低于75％)、因为纯度低、中和效价不高，造成约有1％出现副作用。目前尚没有一种抗天花病毒的免疫球蛋白上市。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为如何获得纯度高、中和效价高的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法。本专利技术所提供的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，包括如下步骤：用免疫原免疫动物，收集血清和/或血浆，去除血清和/或血浆中IgG的Fc段，收集F(ab′)2，得到抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2；所述免疫原包括未灭活或灭活的痘苗病毒抗原。上述制备方法中，所述痘苗病毒抗原具体的为痘苗病毒天坛株或痘苗病毒安卡拉株。上述制备方法中，所述血清和/或血浆的中和抗体效价≥1∶3200。本专利技术用免疫原免疫动物的免疫方案必须借助免疫学基本原理，合理设计候选免疫方案，免疫动物测定中和效价后确定，对抗原类型、免疫佐剂、免疫剂量、免疫次数和间隔时间进行系统地优化，最终选定。上述制备方法中，所述免疫原由抗原和佐剂组成。佐剂的作用为增强抗原的免疫原性，大幅度提高中和效价。因此筛选合适的佐剂有助于提高中和效价。本专利技术所述佐剂可以为完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、白油佐剂等，具体的为白油佐剂。上述制备方法中，所述灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，以灭活的痘苗病毒的蛋白质量计，每次免疫的免疫剂量依次为2μg/kg、4μg/kg、4μg/kg、4μg/kg；所述未灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，每次免疫的免疫剂量依次为1×105PFU/kg、1.2×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg。上述制备方法中，进一步还包括在去除血清和/或血浆中IgG的Fc段前对收集的血清和/或血浆采用S/D病毒灭活溶液进行外源病毒灭活得到灭活的血清和/或血浆的步骤，所述S/D病毒灭活溶液为TritonX-10010％，TNBP3％，溶剂为PBS。上述制备方法中，进一步还包括将所述灭活的血清和/或血浆按照如下方法去除血清和/或血浆中IgG的Fc段：1)采用胃蛋白酶切割；2)采用包括硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和分子筛层析的步骤进行纯化。本专利技术利用硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和分子筛层析的联合方法进行纯化，大幅度提高了F(ab′)2的纯度和中和效价，F(ab′)2片段纯度从传统的75％提升至85％以上，中和效价从1∶3200提升至1:12800以上。在本专利技术具体的实施方式中，所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE(阴离子交换树脂，公司GE，货号17-0500-01)，所采用的洗脱程序包括如下步骤洗脱：第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积。在本专利技术具体的实施方式中，所述分子筛层析所采用的洗脱程序用2倍柱体积的PBS缓冲液(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)进行洗脱。上述制备方法中，所述动物为马、牛、羊或骆驼等大型动物。上述制备方法中，所述灭活的痘苗病毒抗原的制备方法如下：采用真核细胞培养生产痘苗病毒；采用甲醛溶液灭活痘苗病毒；用蔗糖密度梯度离心结合阴离子交换柱层析或者透析方法或者分子筛层析纯化灭活痘苗病毒，最终得到纯化后的灭活痘苗病毒抗原。该抗原经SDS-PAGE后薄层扫描法和HPLC法检测，纯度超过85％。具体的，所述灭活是将痘苗病毒培养液和甲醛溶液进行混合得到甲醛体积含量为0.01％的液体，在20～25℃放置72h进行灭活。具体的，所述蔗糖密度梯度的蔗糖浓度梯度为28％，32％，36％，40％，44％5个梯度。具体的，所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序包括如下步骤洗脱：第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积。具体的，所述分子筛层析所采用的洗脱程序用2倍柱体积的PBS(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)进行洗脱。具体的，所述真核细胞包括鸡胚成纤维细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)

【技术特征摘要】
1.一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：用免疫原免疫动物，收集血清和/或血浆，去除血清和/或血浆中IgG的Fc段，收集F(ab′)2，得到抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2；所述免疫原包括未灭活或灭活的痘苗病毒抗原。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述免疫原由抗原和佐剂组成。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、白油佐剂中任一种或多种，具体的为白油佐剂。


4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：所述灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，以灭活的痘苗病毒的蛋白质量计，每次免疫的免疫剂量依次为2μg/kg、4μg/kg、4μg/kg、4μg/kg；
所述未灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，每次免疫的免疫剂量依次为1×105PFU/kg、1.2×105PFU/kg、1.6×105PFU...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵忠鹏，谷宏婧，李靖，李敏，杨晓岚，王希良，杨鹏辉，段越强，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11