抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用，该杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201720，该杂交瘤细胞能够分泌效价高的单克隆抗体，获得抗体能够与HPV16阳性的细胞株CaSki和HPV16阳性宫颈癌鳞癌石蜡组织切片反应，具有很好的特异性；可以作为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒或免疫荧光试剂盒。

Monoclonal antibody 69a6 against HPV16E7, hybridoma cells and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗HPV16E7蛋白单抗69A6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，还涉及由该细胞分泌的单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
宫颈癌是全球妇女癌症中居第四位的癌症，每年新增530，000病例和死亡275，000例，这些病例中大约85％来源于发展中国家。在中国，宫颈癌发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(Highriskhumanpapillomavirus，HR-HPV)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的直接病因，其中HPV16型最高，占53％。HPVE7蛋白是HPV致癌的关键分子，E7致癌蛋白选择性表达在肿瘤细胞中，不在正常细胞中表达，随着宫颈上皮内瘤变CIN从低级别向高级别(从CIN1经历CIN2再到CIN3)进展，E7致癌蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高，最终致癌蛋白E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。HR-HPVDNA检测联合细胞学检查(如TCT)，可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3的检出率并减少宫颈癌的发生，共同检测方法也可增加宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。对30～65岁女性进行细胞学和HPVDNA共同检测，不可避免会出现少部分细胞学检查结果阴性但HR-HPVDNA检测阳性者。美国最新的宫颈癌筛查指南提供了2种方案：(1)在12个月时重复细胞学和HR-HPVDNA共同检测。如果重复共同检测时HPVDNA阳性或细胞学检查结果为LSIL或更严重者，则应行阴道镜检查；(2)立即行HPV基因分型检测(HPVl6或HPVl8)。新的筛查指南对HR-HPVDNA检测结果阳性者缺乏肯定、一致的处理方案，而且阴道镜检查是有创伤的检查，也增加患者心理负担和经济负担，主要因为HR-HPV的DNA检测阳性不能预测哪些患者最终发展为宫颈内瘤变CIN1、CIN2、CIN3和宫颈浸润癌，但如果补充检测HR-HPV的E7致癌蛋白比如HPV16E7、HPV18E7致癌蛋白等，就可以间接提示宫颈有癌细胞的存在，很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在，最终达到早期预警、早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供抗HPV16E7蛋白单抗69A6；本专利技术的目的之二在于提供分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞；本专利技术的目的之三在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的制备方法；本专利技术的目的之四在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6在制备检测抗体中的应用；本专利技术的目的之五在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用；本专利技术的目的之六在于提供含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的试剂盒。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、抗HPV16E7蛋白单抗69A6，所述单抗69A6包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.6的第50-54位、第69～85位、第118～127位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQIDNO.8的第46～55位、第71～77位和第110～118位所示。优选的，单抗重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。优选的，单抗重链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；单抗轻链核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。更优选的，所述单抗69A6由杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C201720。2、分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C201720。3、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的制备方法，包括如下步骤：以HPV16E7蛋白为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术将SP2/0与免疫BALB/c小鼠的脾细胞或淋巴结细胞融合，筛选稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白的杂交瘤细胞株，制备单抗腹水，经纯化获得抗HPV16E7蛋白单抗69A6。4、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6在制备检测抗体中的应用。5、所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用。6、含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6的试剂盒。优选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或WesternBlot检测试剂盒；更优选的，所述ELISA试剂盒为双抗夹心ELISA试剂盒，以单抗79A11为捕获抗体时，单抗69A6为检测抗体检测抗原HPV16E7蛋白。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能够分泌抗HPV16E7蛋白单抗69A6，可以用于HPV16E7蛋白的定量检测，并且具有特异性好、灵敏度高的优点，对宫颈癌早期诊断具有重要意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为WesternBlot检测纯化HPV16E7蛋白与组氨酸标签抗体反应结果。图2为单抗69A6用ProteinA纯化的10％SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1～6：纯化蛋白)。图3为间接ELISA测定单抗69A6的最高效价图。图4为4对可以配对单抗的单抗。图5为单抗69A6与CaSki和HeLa的总蛋白的WesternBlot反应图。图6为单抗69A6与CaSki细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。图7为单抗69A6与HeLa细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。图8为单抗69A6与CaSki和HeLa细胞的免疫细胞化学反应(10*20)(单抗69A6从7.8125ng/片两倍增加到1μg/片共8个浓度时，分别与CaSki细胞反应都有棕黄色颗粒出现，分别与HeLa细胞反应都没有出现棕黄色颗粒)。图9为69A6与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌、HPV18阳性的宫颈癌腺癌的免疫组织化学(10*20)(单抗69A6与HPV16阳性的宫颈鳞癌组织反应后都有棕黄色颗粒的出现，而单抗69A6与HPV18阳性的宫颈腺癌组织反应后都没有棕黄色颗粒的出现)。图10为单抗69A6的表位鉴定结果图(A：重叠肽的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69A6的优势线性B细胞表位；重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69A6的优势线性B细胞表位；C：单抗69A6的表位在HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图中的定位)。保藏说明将3株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株79A11、69A6和69E2送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为HPV16E7-79A11、HPV16E7-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗HPV16E7蛋白单抗69A6，其特征在于：所述单抗69A6包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6的第50-54位、第69～85位、第118～127位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.8的第46～55位、第71～77位和第110～118位所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗HPV16E7蛋白单抗69A6，其特征在于：所述单抗69A6包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.6的第50-54位、第69～85位、第118～127位所示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQIDNO.8的第46～55位、第71～77位和第110～118位所示。


2.根据权利要求1所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6，其特征在于：单抗重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；单抗轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


3.根据权利要求1所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6，其特征在于：单抗重链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；单抗轻链核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


4.根据权利要求1～3人一项所述抗HPV16E7蛋白单抗69A6，其特征在于：所述单抗69A6由杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C201720。


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【专利技术属性】
技术研发人员：崔红娟，胡仁建，张奎，李重阳，潘光照，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50