一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用技术方案

本发明专利技术涉及一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，所述系统为蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸‑碱‑酶稳定的双组分微球，该双组分微球为均匀包裹壳聚糖的工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸‑碱‑酶稳定微球。本发明专利技术光响应型工程菌肠道光遗传载体系统为一种蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸‑碱‑酶稳定的双组分微球，形貌均一，分散性好，可靶向炎症性肠病病灶部位，同时释放蓝光响应的工程菌BL21和稀土纳米材料@酸‑碱‑酶稳定微球，利用“光遗传技术”实现外源工程菌的精准有效定植，进一步实现对炎症性肠病的缓解与治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用
本专利技术属于生物技术和医药
，尤其是一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用。
技术介绍
临床应用表明，重组工程菌移植在艰难梭菌感染、炎症性肠病、糖尿病、癌症、肝硬化及相关脑病的预防、缓解和治疗中发挥着不可或缺的作用。已有研究报道，通过重组工程菌定植可缓解临床上90％的艰难梭菌感染症状；在帕金森病动物模型中，重组工程菌移植在调节运动功能缺损和神经炎症方面也发挥重要作用。此外，与口服或注射用药相比，细菌作为肠道的内生“药物工厂”，更适合小分子蛋白质和多肽药物的递送，避免了药物递送过程中的降解和免疫排斥。传统的重组工程菌定植方法依赖于细菌本身的随机沉降，从而使工程菌的定植周期和定植位置无法控制，导致重组工程菌临床推广应用处于停滞状态。一般来说，重组工程菌成功定植的必要条件是重组菌锚定于肠上皮细胞或黏膜层。这种锚定现象取决于细菌表面黏附蛋白与其相互作用。有报道称，乳酸菌表面形成菌毛的SpaCBA蛋白复合物是使其黏附于宿主肠道肠上皮细胞和黏液层的原因。其中微生物具有不同的黏附相关大分子(蛋白质、血凝素和多聚糖等)分泌系统，通过调控的方式来控制微生物分泌预期数量的大分子，使外源工程菌时空精准地定植于宿主特定肠断(十二指肠、空肠、回肠、结肠等)，有望解决重组工程菌移植面临的临床难题。本申请人设想通过调控使工程菌在“开”和“关”状态下相互转化。在“开”状态下，工程菌分泌黏连蛋白协助定植，在“关”状态下，工程菌处于静息状态。目前，小分子物质调控系统，如tetracycline-inducedTetR系统和BHT-inducedPR-α系统，已用来影响工程菌的生物学功能。然而，由于在复杂的肠道环境中难以追踪化学诱导物质，因此增加了精准调控的难度。“光遗传技术”的时空精度在神经调节领域中表现突出。其中，光遗传调控方法通过遗传编码光依赖受体或光敏感转录元件已在细胞分辨率水平上实现了对神经元的精确操作。与化学诱导剂相比，光以其毒性小、快速激活和失活等优点在控制细胞行为方面表现出巨大潜力。利用光作为媒介，如蓝光敏感的pDawn系统和红光敏感的Cph8系统，已经能够准确地调控细菌的基因表达。通过检索，尚未发现与本专利申请相关的公开专利文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，所述系统为蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定的双组分微球，该双组分微球为均匀包裹壳聚糖的工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球；所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球包括工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1、稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球和海藻酸钠；所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有高效递送工程菌BL21和稀土纳米材料的双组分递送功能；所述工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1包含光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43、工程菌表面展示因子TGF-β1；所述光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43具有光控定位功能，工程菌表面展示因子TGF-β1能够与肠道黏膜系统共同承担免疫协同功能；所述混合稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有将近红外光转换成可视光源的功能。而且，所述近红外光为980nm.。而且，所述双组分微球粒径为400-1000μm，所述稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球粒径为80-1000μm。而且，所述双组分微球的粒径通过调节微流控平台中内外两相流体的流速控制。而且，所述系统为一种智能化、精准化、可视化和无创化的外源工程菌高效递送，该系统利用光遗传技术激活光响应外源工程菌，实现外源工程菌在宿主肠道病灶部位的靶向有效定植，进一步实现外源光响应工程菌发挥免疫调控的时空精准性。如上所述的载体系统的制备方法，具体方法如下：⑴制备稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球：称取稀土纳米材料溶于预聚液中，稀土纳米材料：预聚液的比例g：mL为0.1-0.5：1-5，预聚液的组成比例为：聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的体积比为5：4-3：1-2，预聚液在制备时，直接将聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮按比例混匀即可；超声分散，避光保存，作为内液；二甲基硅油作为外液；然后制备粒径均一的稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球，其中内液的流速为10-160uL/min，内液与外液的流速比为1:30-40；⑵构建蓝光响应型大肠杆菌BL21工程菌株：利用PCR技术从模板Addgene#107742扩增pDawn-Ag43片段；利用PCR技术将载体pUC19线性化，并避开原有启动子区域；利用同源重组，将pDawn-Ag43片段与pUC19载体连接，构建的质粒pUC19-pDawn-Ag43首先转化DH5a感受态菌株，测序获得重组阳性质粒；在此基础上构建含有绿色荧光蛋白GFP报告基因的大肠杆菌BL21表达质粒pUC19-pDawn-Ag43-GFP及含有转换生长因子TGF-β1免疫因子的大肠杆菌BL21表达质粒pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1；⑶构建光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统：将培养至OD＝0.3-0.6的工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1离心重悬后，混合稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球，加入到质量分数为0.1-0.5％的海藻酸钠溶液中，其中工程菌BL21p8UC19-pDawn-Ag43-TGF-β1：稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球：海藻酸钠溶液的体积比为1-2:1:7-8；搅拌均匀后作为内液；二甲基硅油与CaCl2超细粉末共混后作为外液，二甲基硅油与CaCl2的比例mL：g为1-5：1；然后制备粒径均一的蓝光响应工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球的双组分微球；其中内液的流速为40-100uL/min，内液与外液的流速比为1：20-40；以上操作均为无菌操作；将制备的双组分微球与质量浓度1％-5％的壳聚糖溶液共混后封装于注射器内，其中双组分微球：壳聚糖溶液的体积比为1:5-10，注射器针头呈45°弯曲，借助注射器的推力，均匀包裹壳聚糖的工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球从注射器针头挤出，冷冻干燥后即得到蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定的双组分微球，包裹壳聚糖的双组分微球能够避免胃酸的腐蚀，使稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球和光响应工程菌精准到达肠道。而且，所述步骤⑴中使用微流控平台制备粒径均一的稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球。而且，所述步骤⑶中使用简易微流控平本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述系统为蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定的双组分微球，该双组分微球为均匀包裹壳聚糖的工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球；/n所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球包括工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1、稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球和海藻酸钠；所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有高效递送工程菌BL21和稀土纳米材料的双组分递送功能；/n所述工程菌BL21 pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1包含光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43、工程菌表面展示因子TGF-β1；所述光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43具有光控定位功能，工程菌表面展示因子TGF-β1能够与肠道黏膜系统共同承担免疫协同功能；/n所述混合稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有将近红外光转换成可视光源的功能。/n

【技术特征摘要】
1.一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述系统为蓝光响应工程菌BL21@pH敏感微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定的双组分微球，该双组分微球为均匀包裹壳聚糖的工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球；
所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球包括工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1、稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球和海藻酸钠；所述工程菌BL21@海藻酸钠微球载稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有高效递送工程菌BL21和稀土纳米材料的双组分递送功能；
所述工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1包含光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43、工程菌表面展示因子TGF-β1；所述光响应启动子pDawn、黏附基因Ag43具有光控定位功能，工程菌表面展示因子TGF-β1能够与肠道黏膜系统共同承担免疫协同功能；
所述混合稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球具有将近红外光转换成可视光源的功能。


2.根据权利要求1所述的光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述近红外光为980nm.。


3.根据权利要求1所述的光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述双组分微球粒径为400-1000μm，所述稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球粒径为80-1000μm。


4.根据权利要求3所述的光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述双组分微球的粒径通过调节微流控平台中内外两相流体的流速控制。


5.根据权利要求1至4任一项所述的光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统，其特征在于：所述系统为一种智能化、精准化、可视化和无创化的外源工程菌高效递送，该系统利用光遗传技术激活光响应外源工程菌，实现外源工程菌在宿主肠道病灶部位的靶向有效定植，进一步实现外源光响应工程菌发挥免疫调控的时空精准性。


6.如权利要求1至5任一项所述的载体系统的制备方法，其特征在于：具体方法如下：
⑴制备稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球：称取稀土纳米材料溶于预聚液中，稀土纳米材料：预聚液的比例g：mL为0.1-0.5：1-5，预聚液的组成比例为：聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的体积比为5：4-3：1-2，预聚液在制备时，直接将聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮按比例混匀即可；超声分散，避光保存，作为内液；二甲基硅油作为外液；然后制备粒径均一的稀土纳米材料@酸-碱-酶稳定微球，其中内液的流速为10-160uL/min，内液与外液的流速比为1:30-40；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉杰，崔梅慧，刘晶，孙韬，潘惠卓，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12