一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法技术

本发明专利技术公开一种检测CAR‑T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其通过设计一段同时包含CAR‑T细胞的目的基因(慢病毒基因)序列及内参基因序列且拷贝数之比为1的DNA序列用于测定引物扩增效率之比，同时设计了特异性的可用于检测绝大部分CAR‑T细胞目的基因的引物与探针，并选用了数字PCR该检测方式，配合使用能减少检测误差，精确地反应CAR‑T细胞基因组中病毒载体拷贝数，从而来确保CAR‑T细胞治疗肿瘤的有效性和安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T,ChimericantigenreceptorTcell)治疗是指通过基因编辑技术改造T细胞，加强T细胞杀伤肿瘤细胞的效果，从而达到治疗肿瘤的目的。药物的安全性是重中之重，尽管CAR-T细胞治疗已经取得一定的进展，但它还属于一个未完全成熟开发的领域，在其开发过程中不断有许多新的技术进入该领域，且人们尚未有足够的数据评估其潜在风险。CAR-T细胞治疗这项技术的难点并不在于前期的细胞治疗，而在后期的细胞治疗副作用如何处理及产品质量的控制。CAR-T细胞不同于传统的药物，其生产工艺复杂、要求高，由于个体化的CAR-T扩增细胞的产品制备工艺是以病人作为供体采集初始细胞材料才能进入工艺过程，即使采用已经在临床进行过充分临床验证的细胞治疗工艺，仍然难以做到如何保证每个肿瘤个体所制备的扩增细胞都质量是一致的。这限制了个体化的CAR-T细胞治疗产品的快速发展，因此提高CAR-T细胞治疗产品的技术安全性、有效性、质量的可控性以及细胞治疗产品制备工艺的一致性是目前细胞治疗产品研发者重点关注的方向。关于载体的基因整合在T细胞的基因组中，一方面可以显示已经对T细胞的基因组进行了基因修饰，一方面又是一个衡量基因安全性的指标。载体基因整合可能给细胞带来一些原癌细胞基因的激活或抑癌细胞基因的失活等危害从而造成二次感染恶性肿瘤的风险，尽管现在对载体的基因整合设计已经大大降低了基因整合的二次感染风险，但这种整合的风险仍未完全得到消除，因此仍需对已被整合到细胞中的基因组载体中的病毒拷贝数进行检测。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种有效、稳定、准确的检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，从而来确保CAR-T细胞治疗肿瘤的有效性和安全性。本专利技术的技术方案如下：一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，包括步骤：针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物序列为SEQIDNO.1，所述CAR-T细胞中的目的基因的反向引物为SEQIDNO.2，所述第一探针序列为SEQIDNO.3。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述第一探针的5’端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述内参基因的正向引物为SEQIDNO.4，反向引物为SEQIDNO.5，探针为SEQIDNO.6。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述第二探针的5’端标记为VIC荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述用于检测引物扩增效率的基因序列为SEQIDNO.7。所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述PCR反应的反应程序为：第一阶段，95℃预变性10分钟，1个循环；第二阶段，95℃变性15秒，65℃延伸1分钟，共40个循环。有益效果：本专利技术针对CAR-T细胞质量控制的需要，分析常用的慢病毒载体序列，设计了可适用于大部分慢病毒载体的引物、探针及用于测定引物扩增效率的标准品序列。利用数字PCR技术配合此引物和探针可对CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数准确定量，为CAR-T细胞治疗产品的有效性和安全性提供保障。附图说明图1为本专利技术提供的一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法较佳实施例的流程图。具体实施方式本专利技术提供一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本
技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本专利技术的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。本
技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本专利技术所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。目前常用的核酸检测方法主要有两种：实时定量PCR检测法及数字定量PCR检测法，其中，数字定量PCR检测方法在定量检测病毒载体拷贝数时准确度更高，且因其不需要设计或制备任何标准的曲线因而更加方便简捷。目前的数字定量PCR检测技术主要是利用先进的油包水样品乳化微滴检测技术与微流体力学检测技术，借助于微滴发生器，将每个油包水样品乳化后生成许多个均匀的纳升级乳化微滴，此时DNA片段和背景序列在乳化微滴中随机地分布。再使用热循环仪对微滴样品进行PCR扩增后通过微滴分析仪的双色光学管路检测逐个地分析每个微滴。这个系统将通过计算核酸阳性和油包水阴性微滴的数量，从而以数字的格式对CAR基因拷贝数进行绝对定量分析。然而，由于现有的数字定量PCR检测方法没有针对目的基因设计引物及探针，也没有设计用于测定引物扩增效率的标准品序列，其仍存检测误差较大，无法精确地反应CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，包括步骤：/n针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；/n设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；/n同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；/n根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，包括步骤：
针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；
设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；
同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；
根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。


2.根据权利要求1所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物序列为SEQIDNO.1，所述CAR-T细胞中的目的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洁莹，汤赞，胡樾，曾桂芳，梁晓，刘沐芸，
申请(专利权)人：深圳科诺医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44