经由pH调节进行的荧光团多路复用制造技术

检测溶液中超过一种分析物的设备，包括至少一个与该溶液接触的电极、包括第一染料和第二染料的至少两种染料，和电化学活性剂，其中该溶液具有pH，该电极配置为通过氧化或还原电化学活性剂来调节溶液的pH，第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光，第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在，且第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。还提供了检测溶液中多种分析物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经由pH调节进行的荧光团多路复用专利
本专利技术的方面涉及检测溶液中多种分析物的设备和方法。背景多路复用是一项通过减少试剂消耗和提高吞吐量来节约成本并在处理珍贵样品时广泛使用的技术。该技术在分析活检样品的应用中是有益的，所述应用如聚合酶链式反应（PCR）、用于检测单个细胞或组织样品中的特定DNA或RNA靶标的荧光原位杂交（FISH）、以及荧光抗体测定。在这些应用中，多路复用的程度通常受到具有非重叠光谱性质的荧光探针的数量和分析仪器上可用的光通道的数量的限制。例如，通常，可以同时在一个PCR管中检测的反应数量限制为五个，主要是因为PCR仪器可以检测不超过四个或五个颜色通道，其中之一可被保留作为参考通道。实时定量PCR（qPCR）可以通过读取来自4至5种具有非重叠光谱性质的不同染料的荧光一次检测4至5种分析物。扩充每个通道的分析物数量的一种策略是组合发射最大值相同但对光漂白的荧光稳定性不同的荧光团。参见Schuler等人,F.Anal.Chem.2016,88(5),2590–2595。但是，这项技术仅能进行终点检测，因为光漂白是不可逆过程，且因此不适于qPCR。其它策略利用通过缓冲液交换、脱盐或透析来改变生物溶液的pH。但是，所有这些方法均会导致一部分样品损失或稀释，耗费时间，并且不适合反复并入qPCR过程。概述下面阐述了本专利技术的某些示例实施方案的概述。应当理解的是，呈现这些方面仅为了向读者提供这些特定实施方案的简要概述，并且这些方面并非意在限制本专利技术的范围。事实上，本专利技术可以涵盖下文中可能未阐述的多个方面。本专利技术的示例实施方案通过利用有机染料的pH依赖性荧光性质增加了可以在单一样品中区分的荧光探针数量。如果两种染料在相同波长下发出荧光（即具有重叠的光谱性质），但具有明显不同的pH特性（例如，一种在酸性或碱性pH下具有更高的荧光，而另一种具有相反的pH行为或对pH变化不敏感），那么可以通过测量在两种不同pH下的信号用相同的检测器（即通道）来检测两种荧光团。通过改变溶液pH调节染料的荧光可以扩展相同数量的通道中可检测的靶标的数量。本专利技术的示例实施方案利用了快速、可逆、可重复且不需要交换溶液以保持qPCR所需基本成分（例如核苷酸、盐、引物、聚合酶、荧光标记探针和DNA）的浓度（除了水合氢离子、羟基和/或缓冲离子的浓度外）的pH调节步骤。本专利技术的示例实施方案利用电化学pH调节，其中水合氢离子浓度因与qPCR溶液接触的电极表面发生的受控电化学反应（氧化或还原）而原位改变。这种方法能够对溶液pH实现动态控制，是可逆的，并在初始一次性添加电活性试剂后可以在整个qPCR过程中重复多次。电化学反应发生的电势低到足以防止qPCR过程的任何其它组分发生电化学变化。该限制主要由氨基酸和核苷酸对氧化/还原的稳定性来限定。参见Arrigan,D.W.M.2007,132,615–632。另一限制是电活性试剂与qPCR组分的化学相容性。美国专利号9,810,688描述了一种电化学pH调节平台，其对溶液pH提供动态的按需控制。与微流体环境结合，该pH调节技术可用于改变微流体通道内部整个溶液的pH。在本专利技术的示例实施方案中，在终点PCR反应的情况下，pH仅需要在扩增过程结束时改变一次以扩展在相同通道中可检测的靶标的数量，并且该步骤无需是可逆的。在本专利技术的示例实施方案中，在实时定量PCR（qPCR）的情况下，pH应在每次扩增循环后改变以构建扩增曲线，且因此该步骤是可逆的。通过消除染料具有非重叠光谱性质的要求，在读出时并入pH调节步骤扩展了可以独立检测的染料的数量。使用具有重叠的吸收和发射光谱但具有不同的pH特性的多种染料使得能够在一锅法中检测更多分析物，而无需改变现有的检测仪器（相同的光源和滤光片可用于读数）。常规用于qPCR且可以容易地购得的染料可用于该方法。根据示例实施方案，检测溶液中超过一种分析物的设备包括：（a）至少一个与该溶液接触的电极；（b）至少两种染料，包括第一染料和第二染料；和（c）电化学活性剂；其中该溶液具有pH，该电极配置为通过氧化或还原电化学活性剂来调节溶液的pH，第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光，第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在，且第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。在一些示例实施方案中，该电化学活性剂是醌。在一些示例实施方案中，第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在中性或碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。在一些示例实施方案中，第一染料在碱性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在酸性或中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。在一些示例实施方案中，第一染料选自LysoSensorGreen、FAM、pHrodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO488、ATTO633、TAMRA、ATTO550、ROX、萘荧光素（naphtafluorescein）和Cy5。在一些示例实施方案中，该设备包括多种染料，其中各种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且其中每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。在一些示例实施方案中，该设备包含在分析仪器的通道内。在一些示例实施方案中，该电极是铂、金、银、铟锡氧化物、掺杂氟的氧化锡、玻璃碳或石墨。根据示例实施方案，检测溶液中多种分析物的方法，其中该溶液包含电化学活性剂和包括第一染料和第二染料的至少两种染料，所述方法包括：（a）向在具有pH的溶液中的电极施加电流或电压；（b）氧化或还原电化学试剂以便将溶液的pH改变至第一pH；（c）测量第一pH下第一染料的荧光，表明存在第一分析物；（d）氧化或还原该电化学试剂以便将溶液的pH改变至第二pH；和（e）测量第二pH下第二染料的荧光，表明存在第二分析物。在一些示例实施方案中，第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在中性或碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。在一些示例实施方案中，第一染料在碱性pH中表现出比第二染料更高的荧光，且第二染料在酸性或中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。在一些示例实施方案中，第一染料选自LysoSensorGreen、FAM、pHrodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO488、ATTO633、TAMRA、ATTO550、ROX、萘荧光素（naphtafluorescein）和Cy5。在一些示例实施方案中，该溶液进一步包括多种染料，其中每种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且其中每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。在一些示例实施方案中，在分析仪器的通道内发生多种分析物的检测。根据示例实施方案，一种设备包括：（a）荧光传感器；（b）包括处理电路的控制单元；（c）配置为将包含多种分析物与相应染料并包含电化学活性剂的溶液保持在其中的容器；（d）和至少一个相对于该容器布置的电极，使得当该容器容纳溶液时，所述至少一个电极与所述溶液接触；其中该处理电路配置为：（i）控制至少一个电极以便进行氧化和还原该电化学活性剂中的至少一种，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测溶液中的多种分析物的设备，所述设备包括：/n至少一个与所述溶液接触的电极；/n至少两种染料，包括第一染料和第二染料；和/n电化学活性剂；/n其中：/n所述溶液具有pH；/n所述电极配置为通过氧化或还原所述电化学活性剂来调节溶液的pH；/n第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光；/n第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在；和/n第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171221 US 15/8511461.检测溶液中的多种分析物的设备，所述设备包括：
至少一个与所述溶液接触的电极；
至少两种染料，包括第一染料和第二染料；和
电化学活性剂；
其中：
所述溶液具有pH；
所述电极配置为通过氧化或还原所述电化学活性剂来调节溶液的pH；
第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光；
第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在；和
第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。


2.权利要求1的设备，其中所述电化学活性剂是醌。


3.权利要求1的设备，其中第一染料在酸性pH中表现出比第二染料更高的荧光。


4.权利要求3的设备，其中第二染料在中性pH中表现出比第一染料更高的荧光。


5.权利要求3的设备，其中第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。


6.权利要求1的设备，其中第一染料在中性pH中表现出比第二染料更高的荧光，并且第二染料在碱性pH中表现出比第一染料更高的荧光。


7.权利要求1的设备，其中第一染料选自LysoSensorGreen、FAM、pHrodo、罗丹明B衍生物、SNARF、ATTO488、ATTO633、TAMRA、ATTO550、ROX、萘荧光素和Cy5。


8.权利要求1的设备，其中各种染料在不同的pH水平下发射荧光，并且每种染料的荧光用于指示不同分析物的存在。


9.权利要求1的设备，其中所述设备包含在分析仪器的通道内。


10.权利要求1的设备，其中所述电极是铂、金、银、铟锡氧化物、掺杂氟的氧化锡、玻璃碳或石墨。


11.检测溶液中多种分析物的方法，其中所述溶液包含电化学活性剂和包括第一染料和第二染料的至少两种染料，所述方法包括：
向在具有pH的溶液中的电极施加电流或电压；
氧化或还原电化学试剂以便将溶液的pH改变至第一pH；
测量第一pH下第一染料的荧光，表明存在第一分析物；
氧化或还原所述电化...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·艾哈迈德，F·拉默尔，J·斯泰格特，C·约翰逊，P·斯塔利，N·福米纳，C·郎，
申请(专利权)人：罗伯特·博世有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE