白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品及其制备方法，涉及细胞流式检测质控技术领域。采用本发明专利技术的制备方法成功制备出白细胞分化抗原CD34的流式检测用质控品。本发明专利技术提供的白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品，作为国内首个用于CD34流式计数检验的质控品，填补了国内在此领域的产品空白，该质控品在性能上与进口试剂接近，操作方法相同，不增加额外的学习成本；并且产品有效期可以稳定保持在45～50天，使用成本远低于进口质控品。使用成本远低于进口质控品。使用成本远低于进口质控品。

【技术实现步骤摘要】
白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品及其制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞流式检测质控
，尤其涉及白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品及其制备方法。

技术介绍

[0002]造血干细胞移植能重建造血功能，且肿瘤细胞污染发生较少，能广泛用于治疗多种恶性血液系统疾病、实体瘤、遗传性疾病、重症联合免疫缺陷病等。造血干细胞的来源主要有外周血、骨髓、脐带血等，其中脐带血中的造血干细胞含量最为丰富，由于其来源丰富、采集方便、储存及移植操作技术越来越简便因此越来越受到广大医患的重视与认可。
[0003]目前评价造血干细胞移植的重要指标为：有核细胞总数及CD34+细胞总数，其中CD34+细胞被认定为细胞是否具备造血功能的关键指标，其检测主要通过流式细胞术单平台（绝对计数）或双平台（计百分率再结合全血细胞计数）法进行检测。
[0004]国内相关法规，如《非血缘造血干细胞一致技术管理规范》、《非血缘造血干细胞采集技术管理规范》、《脐带血造血干细胞库技术规范（试行）》和《造血干细胞移植技术管理规范（2017年版）等15个“限制临床应用”医疗技术管理规范和质量控制指标》等文件中，对干细胞CD34+细胞计数和质量控制均做出了相应的要求。为确保检验结果的准确及监控检验过程质量稳定，检验系统中均会采用检验质控品进行室内质量控制。
[0005]目前对于CD34流式计数检验质控品，国内生产仍为空白，只能依赖国外进口，市场上目前已有的此类进口质控品生产商主要为美国BD公司、美国Beckman Coulter公司、美国R&D公司以及美国Streck公司。由于进口全血质控品价格昂贵、入关手续繁琐、国内用户收到产品后可使用的有效期短、以及适用性差等原因，限制了许多检验实验室此检验项目的室内质控活动，从而导致此项检验项目在各实验室间检测结果可比性差、质量不可控，从而影响临床造血干细胞移植的判断及疗效。
[0006]目前国内检验室所使用的CD34流式计数检验质控品均为进口，产品有效期一般为90天。由于这些质控品为血液制品，因此入关手续非常繁琐，在到达用户端后可以使用的有效期仅剩下不到30天，更进一步缩短了用户可以使用的有效期。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对
技术介绍
中提及的问题提供一种白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品，该质控品即填补了国内的产品空白，又解决了进口质控品到达用户端后使用有效期短的问题，降低了用户端的使用成本。同时提供一种白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品的制备方法。
[0008]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品的制备方法，包括以下步骤：S1，表达载体的构建：利用基因工程技术进行扩增，获得编码白细胞分化抗原CD34
的基因，将该基因片段插入表达载体中，得到CD34表达载体；所述白细胞分化抗原CD34的氨基酸序列为SEQ NO.1或SEQ NO.2；S2，病毒载体的包装：将所述CD34表达载体与包装质粒转染于包装细胞系中，获得含有编码白细胞分化抗原CD34基因的病毒；S3，靶细胞感染：将S2得到的病毒感染靶细胞，使含有编码白细胞分化抗原CD34基因整合至靶细胞的基因组中并表达白细胞分化抗原CD34；S4，磁珠分选CD34阳性细胞：将被感染后的靶细胞通过CD34抗体磁珠，筛选出合格的CD34阳性细胞株；S5，CD34阳性细胞扩大培养：对合格的CD34阳性细胞株扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
109cells及以上时，按照第一预设浓度分装至冻存管中，作为第一代种子细胞，于液氮中冻存；取1支第一代种子细胞，进一步扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
109cells及以上时，按照第二预设浓度分装至冻存管中，作为第二代种子细胞，于液氮中冻存；取1支第二代种子细胞，进一步扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
109cells及以上时，按照第三预设浓度分装至冻存管中，作为工作细胞，于超低温冰箱中冻存备用；S6，获取血细胞：取外周血，并对外周血白细胞计数，将白细胞浓度在4.0
×
109~ 10.0
×
109cells/L范围内的外周血在低温环境下进行离心，分离出血浆与血细胞；S7，CD34阳性细胞与血细胞混合并固定：将S5得到的工作细胞按预设比例加入到S6得到的血细胞中，得到混合细胞；对所述混合细胞进行固定，得到固定好的混合细胞；将固定好的混合细胞配成质控品，将质控品冷藏于4℃ ~ 8℃保存；其中，所述预设比例为，在CD34
+
低值质控品中，CD34阳性细胞在外周血白细胞中所占比例为0.1% ~ 0.3%；CD34
+
高值质控品中，CD34阳性细胞在外周血白细胞中所占比例为0.3% ~ 0.6%。
[0009]其进一步的技术方案为，所述靶细胞为nalm6细胞、KG
‑
1a细胞、Jurkat细胞或daudi细胞中的任一种。
[0010]其进一步的技术方案为，所述步骤S1中，表达载体选自pCDH
‑
EF1
‑
MCS
‑
T2A
‑
Puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
copGFP、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
copGFP
‑
T2A
‑
puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
RFP、或，CDH
‑
MCS
‑
T2A
‑
puro
‑
MSCV中的任一种。
[0011]其进一步的技术方案为，所述步骤S2中，包装质粒选自以下组合中的任一种：组合1：pMD2.G、pRSV
‑
rev和pMDLg/pRRE；组合2：pPACKH1
‑
GAG、pPACKH1
‑
REV和pVSV
‑
G；组合3：pMD2.G和psPAX2。
[0012]其进一步的技术方案为，所述步骤S4中，将被感染后的靶细胞通过CD34抗体磁珠筛选出初CD34阳性细胞株，再用流式细胞仪对初CD34阳性细胞株进行第二次筛选，将测得阳性率在97%及以上的初CD34阳性细胞株作为合格的CD34阳性细胞株。
[0013]其进一步的技术方案为，所述步骤S5中，第一预设浓度、第二预设浓度和/或第三预设浓度的范围为0.5
×
10
7 ～1.5
×
107c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，表达载体的构建：利用基因工程技术进行扩增，获得编码白细胞分化抗原CD34的基因，将该基因片段插入表达载体中，得到CD34表达载体；所述白细胞分化抗原CD34的氨基酸序列为SEQ NO.1或SEQ NO.2；S2，病毒载体的包装：将所述CD34表达载体与包装质粒转染于包装细胞系中，获得含有编码白细胞分化抗原CD34基因的病毒；S3，靶细胞感染：将S2得到的病毒感染靶细胞，使含有编码白细胞分化抗原CD34基因整合至靶细胞的基因组中并表达白细胞分化抗原CD34；S4，磁珠分选CD34阳性细胞：将被感染后的靶细胞通过CD34抗体磁珠，筛选出合格的CD34阳性细胞株；S5，CD34阳性细胞扩大培养：对合格的CD34阳性细胞株扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
10
9 cells及以上时，按照第一预设浓度分装至冻存管中，作为第一代种子细胞，于液氮中冻存；取1支第一代种子细胞，进一步扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
10
9 cells及以上时，按照第二预设浓度分装至冻存管中，作为第二代种子细胞，于液氮中冻存；取1支第二代种子细胞，进一步扩大培养，当培养的细胞数量达到1
×
10
9 cells及以上时，按照第三预设浓度分装至冻存管中，作为工作细胞，于超低温冰箱中冻存备用；S6，获取血细胞：取外周血，并对外周血白细胞计数，将白细胞浓度在4.0
×
10
9 ~ 10.0
×
10
9 cells/L范围内的外周血在低温环境下进行离心，分离出血浆与血细胞；S7，CD34阳性细胞与血细胞混合并固定：将S5得到的工作细胞按预设比例加入到S6得到的血细胞中，得到混合细胞；对所述混合细胞进行固定，得到固定好的混合细胞；将固定好的混合细胞配成质控品，将质控品冷藏于4℃ ~ 8℃保存；其中，所述预设比例为，在CD34
+
低值质控品中，CD34阳性细胞在外周血白细胞中所占比例为0.1% ~ 0.3%；CD34
+
高值质控品中，CD34阳性细胞在外周血白细胞中所占比例为0.3% ~ 0.6%。2.如权利要求1所述的白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品的制备方法，其特征在于，所述靶细胞为nalm6细胞、KG
‑
1a细胞、Jurkat细胞或daudi细胞中的任一种。3.如权利要求1所述的白细胞分化抗原CD34流式检测用质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，表达载体选自pCDH
‑
EF1
‑
MCS
‑
T2A
‑
Puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
copG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鹏，刘沐芸，梁晓，董文婵，侯凯翔，王丹，
申请(专利权)人：深圳科诺医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：